Modello immunocompetente di alveoli su chip per lo studio delle risposte immunitarie della mucosa alveolare

Riepilogo

I modelli Lung-on-chip superano le tradizionali colture 2D imitando l'interfaccia aria-liquido e la perfusione delle cellule endoteliali, simulando il flusso sanguigno e lo scambio di nutrienti cruciali per gli studi di fisiologia polmonare. Ciò migliora la rilevanza della ricerca polmonare, offrendo un ambiente dinamico e fisiologicamente accurato per far progredire la comprensione e il trattamento delle infezioni respiratorie.

Abstract

Introduciamo un modello avanzato immunocompetente lung-on-chip progettato per replicare la struttura e la funzione alveolare umana. Questo modello innovativo impiega un biochip microfluidico-perfuso che supporta un'interfaccia aria-liquido che imita l'ambiente negli alveoli umani. L'ingegneria tissutale viene utilizzata per integrare componenti cellulari chiave, tra cui cellule endoteliali, macrofagi e cellule epiteliali, per creare un modello tissutale rappresentativo dell'alveolo. Il modello facilita esami approfonditi delle risposte immunitarie della mucosa a vari agenti patogeni, tra cui virus, batteri e funghi, migliorando così la nostra comprensione dell'immunità polmonare. L'obiettivo principale di questo protocollo è fornire dettagli per stabilire questo modello di alveolo su chip come una solida piattaforma in vitro per studi sulle infezioni, consentendo ai ricercatori di osservare e analizzare da vicino le complesse interazioni tra i patogeni e il sistema immunitario dell'ospite all'interno dell'ambiente polmonare. Ciò si ottiene attraverso l'applicazione di tecniche basate sulla microfluidica per simulare le condizioni fisiologiche chiave degli alveoli umani, tra cui il flusso sanguigno e la stimolazione biomeccanica delle cellule endoteliali, oltre a mantenere un'interfaccia aria-liquido cruciale per l'esposizione realistica delle cellule epiteliali all'aria. Il sistema modello è compatibile con una serie di test standardizzati, come la colorazione in immunofluorescenza, la profilazione delle citochine e l'analisi delle unità formanti colonie (CFU)/placche, consentendo una visione completa delle dinamiche immunitarie durante l'infezione. L'Alveolus-on-chip è composto da tipi di cellule essenziali, tra cui le cellule epiteliali polmonari distali umane (H441) e le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) separate da membrane porose in polietilene tereftalato (PET), con macrofagi primari derivati da monociti posizionati strategicamente tra gli strati epiteliale ed endoteliale. Il modello tissutale migliora la capacità di sezionare e analizzare i fattori sfumati coinvolti nelle risposte immunitarie polmonari in vitro. Come strumento prezioso, dovrebbe contribuire al progresso della ricerca polmonare, fornendo un modello in vitro più accurato e dinamico per studiare la patogenesi delle infezioni respiratorie e testare potenziali interventi terapeutici.

Introduzione

Il polmone umano ha un ruolo notevole nella respirazione e nella difesa immunitaria, con complesse interazioni tra le risposte immunitarie della mucosa alveolare¹. La capacità degli alveoli di creare una risposta immunitaria efficiente è fondamentale per prevenire le infezioni polmonari e garantire la salute polmonare. Poiché i polmoni sono costantemente esposti a un'ampia gamma di potenziali rischi, tra cui batteri, virus, funghi, allergie e particolato, comprendere la complessità delle risposte immunitarie della mucosa alveolare è fondamentale per scoprire i meccanismi alla base delle infezioni respiratorie, dei disturbi infiammatori e del trattamento delle malattie polmonari¹.

Per studiare in vitro i processi correlati all'infezione e all'infiammazione delle vie respiratorie, sono necessari modelli in grado di imitare fedelmente l'ambiente alveolare e le risposte immunitarie. Le colture cellulari 2D e i moduli animali sono stati utilizzati per decenni come strumenti essenziali per la ricerca biomedica sulla risposta immunitaria polmonare. Tuttavia, spesso hanno limitazioni nel loro potenziale traslazionale per le situazioni umane. I modelli Lung-on-chip possono contribuire a colmare il divario tra i tradizionali modelli in vitro e in vivo e fornire un nuovo approccio allo studio delle risposte immunitarie specifiche per l'uomo ^2,3. I modelli lung-on-chip possono imitare l'interfaccia aria-liquido, necessaria alle cellule polmonari per ricapitolare le condizioni fisiologiche del tratto respiratorio e per sviluppare un modello tissutale più accurato e robusto. Questa tecnica di coltura consente un esame preciso della differenziazione cellulare, del funzionamento e delle risposte ai farmaci o agli stimoli correlati alla malattia in vitro².

In questo studio, presentiamo un modello basato sulla microfluidica dell'alveolo umano come strumento efficace per ricapitolare l'ambiente alveolare umano applicando la perfusione per imitare il flusso sanguigno e la stimolazione biomeccanica delle cellule endoteliali e incorporando un'interfaccia aria-liquido con cellule epiteliali esposte verso una fase aerea⁴. Abbiamo sviluppato un alveolo microfluidico perfuso su chip che imita la struttura fisica e le interazioni biologiche dell'alveolo umano, con particolare attenzione all'interfaccia aria-liquido. Questa interfaccia svolge un ruolo cruciale nella differenziazione delle cellule epiteliali respiratorie, essenziale per modellare accuratamente l'ambiente polmonare. Il modello utilizza cellule epiteliali polmonari distali umane (H441) e cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVECs), separate da membrane porose in polietilene tereftalato (PET), con macrofagi primari derivati da monociti posizionati tra gli strati cellulari. Questa configurazione replica l'intricata disposizione cellulare dell'alveolo ed è fondamentale per simulare accuratamente l'interfaccia aria-liquido, che è un fattore significativo nella funzione fisiologica del tessuto polmonare.

Il razionale alla base dello sviluppo del modello si estende all'integrazione delle cellule immunitarie circolanti e residenti nei tessuti. Questo approccio è progettato per imitare accuratamente la risposta infiammatoria dell'ospite alle infezioni respiratorie umane, fornendo un ambiente dinamico per studiare le interazioni patogeno-ospite. La presenza di macrofagi consente l'esame delle risposte immunitarie immediate e della loro interazione con i patogeni, riflettendo la prima linea di difesa contro le infezioni respiratorie. Inoltre, il design della piattaforma di biochip facilita la manipolazione comoda e precisa di segnali biofisici e biochimici, che è fondamentale per replicare la funzione degli alveoli in vitro. Questa flessibilità è fondamentale per sezionare i fattori che contribuiscono alle infezioni umane, consentendo ai ricercatori di regolare le condizioni per riflettere vari stati patologici o di testare potenziali interventi terapeutici. La compatibilità della piattaforma con diverse tecnologie di lettura, tra cui la microscopia avanzata, le analisi microbiologiche e l'analisi biochimica degli effluenti, ne migliora l'utilità. Queste capacità consentono una valutazione completa della risposta tissutale alle infezioni, compresa la valutazione del comportamento cellulare, della proliferazione dei patogeni e dell'efficacia delle risposte immunitarie.

Presentiamo un protocollo dettagliato e tecniche per creare e utilizzare un modello di alveolo umano su chip incentrato sulla replicazione dell'interfaccia aria-liquido e sull'integrazione delle cellule immunitarie per studiare le infezioni umane in vitro.

Protocollo

Le cellule HUVEC sono isolate dal cordone ombelicale e utilizzate fino al passaggio 4. I monociti primari sono isolati da donatori sani da sangue intero. Lo studio è stato approvato dal comitato etico dell'Ospedale universitario di Jena, Jena, Germania (3939-12/13). Secondo la Dichiarazione di Helsinki, tutti gli individui che hanno donato cellule per lo studio hanno dato il loro consenso informato.

1. Giorno 1: Preparazione del biochip

1. I biochip sono disponibili in diverse dimensioni e modelli. Per gli esperimenti, utilizzare il modello BC002. Posizionare il biochip in una capsula di Petri di vetro, riempire la capsula e lavare tutte le cavità con etanolo sterile al 70% (EthOH). Incubare per 45 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, sciacquare le cavità 2 volte con ddH₂O. Rimuovere il ddH₂O.
2. Rivestire la membrana del biochip di entrambe le cavità con una soluzione sterile di collagene IV (0,5 mg/mL in acido acetico 0,5 mM; utilizzare una concentrazione di 1:100 nella soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco contenente magnesio e calcio PBS (+/+)) lavando delicatamente la soluzione di collagene IV attraverso entrambe le cavità utilizzando una pipetta da 1.000 μL con punte blu. Incubare per 15 minuti a 37 °C e 5% di CO₂.
   NOTA: Si consiglia di utilizzare una pipetta da 1.000 μl con puntali con filtro blu (P1000) durante l'intero protocollo. Il diametro dell'apertura della punta del filtro copre completamente l'apertura delle porte che collegano i canali, evitando l'inserimento di bolle d'aria nel chip.
3. Dopo 30 minuti di incubazione, sciacquare le camere inferiore e superiore 2 volte con PBS sterile (+/+) per eliminare il collagene e l'acido acetico rimanenti.
4. Preparare il terreno EC aggiungendo 1:100 (v/v) Penicillina/Streptomicina (10.000 U/mL). Riempire la camera superiore di ciascuna cavità con 250 μL di terreno EC e la camera inferiore con 150 μL di terreno EC.
5. Prelevare l'HUVEC da un pallone confluente in T25: lavare con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco senza PBS di magnesio e calcio (-/-), aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,25% + 1 mM di EDTA in PBS (-/-) e incubare per 3 minuti a 37 °C. Arrestare l'attività della tripsina aggiungendo 5 mL di PBS (+/+) + 5% FCS e centrifugare a 350 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) in una provetta conica da 50 mL. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno EC.
6. Utilizzare una diluizione seriale 1:10 quando si esegue il conteggio delle cellule. Aggiungere 10 μl di pellet di cella risospesa a 90 μl di terreno cellulare. Combina i campioni con cura. Utilizzare una provetta da microcentrifuga con 10 μL di colorante blu di tripano. Diluire la soluzione cellulare con blu di tripano (1:1) utilizzando i vetrini della camera di conteggio delle cellule. Conteggio manuale delle celle con una camera Neubauer o con un contatore di celle automatizzato. Determinare la conta delle cellule e regolare la concentrazione a 0,4 x 10⁶ cellule per 200 μl.
7. Sostituire il terreno cellulare endoteliale nella camera superiore del biochip con 200 μl di terreno EC contenente HUVEC sospesi. Pipettare delicatamente per evitare la formazione di bolle d'aria nei canali o nelle camere. Posizionare la capsula di Petri in vetro con i biochip a 37 °C e 5% di CO_2.

2. Giorno 2: Controllo dello strato cellulare

1. Il giorno 2, controllare visivamente la confluenza dello strato cellulare HUVEC nella camera superiore. Eseguire lo scambio del fluido nella camera superiore con 300 μL di terreno EC. Pipettare delicatamente per evitare il distacco delle cellule dalla membrana. Esegui lo scambio di media ogni giorno dopo 24 ore. Posizionare la capsula di Petri in vetro con i biochip a 37 °C e 5% di CO₂.

3. Giorno 3: Preparazione della camera bassa

1. Controllare visivamente la confluenza dello strato di cellule endoteliali. A questo punto, determinare la presenza di uno strato confluente e di una morfologia simile a un ciottolo (Figura 1). Eseguire lo scambio del fluido nella camera superiore con 300 μL di terreno EC.
2. Successivamente, preparare la camera inferiore per la semina delle cellule che formano lo strato epiteliale. Lavare delicatamente la camera inferiore con 150 μL di terreno RPMI (aggiungere 1:100 (v/v) Penicillina/Streptomicina (10.000 U/mL), 5% di siero fetale di vacca, 1 μM di desametasone).
3. Per la camera inferiore, seminare 0,5 x 10⁶ cellule H441 sospese in 200 μL di terreno RPMI (RPMI) per cavità.
4. Raccolta di cellule H441
   1. Lavare le cellule con 5 ml di PBS (-/-) una volta. Aggiungere 2 mL di tripsina allo 0,25% + 1 mM EDTA in PBS (-/-).
   2. Incubare le cellule per 5 minuti a 37 °C e 5% di CO₂. Il tempo di incubazione varia a seconda della confluenza dello strato. Entro 5-7 minuti, le cellule dovrebbero staccarsi completamente.
   3. Arrestare l'attività della tripsina con 10 mL di PBS (+/+) + 5% FBS, raccogliere le cellule e centrifugare a 200 x g per 4 min.
   4. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante, risospendere il pellet in 1 mL di RPMI e contare.
   5. Seminare 0,5 x 10⁶ cellule per camera pipettando delicatamente la soluzione cellulare nella camera inferiore. Chiudere tutte le porte e capovolgere il biochip in modo che le cellule possano attaccarsi alla membrana in PET. Tenere il biochip capovolto e incubare per una notte in un incubatore per colture cellulari a 37 °C e 5% di CO₂.

4. Giorni 4 - Giorno 7: Mantenimento delle cellule e raccolta dei monociti

1. Eseguire lo scambio quotidiano del fluido nella camera superiore e inferiore. Per la camera superiore, eseguire lo scambio del terreno con 300 μL di terreno EC.
2. Utilizzare 200 μL di RPMI+ (terreno RPMI più 1:100 (v/v) Penicillina/Streptomicina (10.000 U/mL), 10 ng/mL GM-CSF, 10% siero umano autologo, 1 μM di desametasone) per la camera inferiore. Il giorno 7, lavare la camera inferiore con RPMI+ per preparare la cavità per la semina dei monociti.
3. Seme 0,1 x 10⁶ monociti sospesi in 200 μL di RPMI+ nella camera inferiore.
4. Raccolta di monociti
   1. Lavare le cellule con 1 mL di PBS (-/-) e incubare per 7 minuti a 37 °C in PBS (-/-) preriscaldato contenente 4 mg/mL di lidocaina + 5 mM di EDTA a 37 °C e 5% di CO₂.
   2. Raccogliere le cellule e centrifugare a 350 x g per 7 minuti, risospendere le cellule in 1 ml di RPMI+ e contare. Posizionare le porte del biochip rivolte verso il basso in modo che le cellule si attacchino alla membrana.

5. Giorno 8: Perfusione di biochip

1. A questo punto, assicurarsi che i biochip siano pronti per essere collegati al flusso e perfusi. Prima di iniziare la perfusione, preparare un'incubatrice vuota e posizionare la pompa peristaltica all'interno.
2. Perfusione dei biochip
   1. Prima di collegare il tubo sterilizzato al biochip, lavare il tubo con 200 μL di PBS (+/+), seguiti da 200 μL di terreno EC. Il tubo ha un diametro interno di 0,5 mm, costituito da lati più lunghi (20 cm) e più corti (12 cm) divisi da due tappi peristaltici della pompa. Metti da parte il tubo e prepara i serbatoi per il fluido.
   2. Eseguire lo scambio del terreno nella camera superiore e inferiore lavandole con il rispettivo terreno di coltura cellulare appena preparato.
   3. Inserire il serbatoio sul lato di uscita del biochip e collegare il serbatoio con il tubo all'ingresso del biochip (Figura 2). Collegare il tubo al serbatoio e al biochip in modo che vi sia una perfusione circolare del mezzo tra il serbatoio e il biochip.
   4. Una volta che tutto è collegato alle porte, riempire il serbatoio con 500 μL di mezzo EC. Collegare il biochip con il tubo su una perfusione con una portata di 21 μL/min (Figura 2). Osservare attentamente durante i primi 15 minuti di perfusione per l'inserimento delle bolle. Eseguire quotidianamente uno scambio medio in entrambe le camere.

6. Giorno 9 - Giorno 11: Stabilire un'interfaccia aria-liquido

1. Arrestare la perfusione, svuotare i serbatoi e riempire con il terreno appena preparato sotto un armadietto di sicurezza sterile. Pipettare 500 μl di terreno EC nei serbatoi e lavare delicatamente la camera inferiore con 200 μl di RPMI+. Riavviare la perfusione con una velocità di perfusione di 21 μl/min.
2. Interfaccia aria-liquido (ALI)
   1. Stabilire l'ALI dal giorno 12 fino alla fine dell'esperimento (giorno 14). Durante la coltura di ALI, esporre le cellule epiteliali all'aria.
   2. Per stabilire la coltura ALI, preparare un nuovo mezzo vascolare EC (aggiungere 1:100 (v/v) Penicillina/Streptomicina (10.000 U/mL), 10 ng/ml di GM-CSF, 20% di siero umano autologo, 1μM di desametasone) per mantenere tutti i tipi di cellule nel chip. A questo punto, il mezzo contiene una concentrazione più elevata di AS (20%).
   3. Aprire i tappi nella camera inferiore sotto un armadio di sicurezza sterile e assorbire con cura il fluido fino a quando non è visibile una bolla d'aria, come mostrato nella Figura 3. Assicurarsi che l'intero liquido dal canale e dalla camera sia stato rimosso e chiudere accuratamente le porte.
   4. Riempire i serbatoi con terreno EC (-/-) e continuare la coltura di perfusione con una portata di 21 μl/min. Scambiare il terreno solo nella camera superiore fino al giorno 14 e mantenere le cellule epiteliali nella camera inferiore solo con aria.

7. Giorno 14: Prelievo e analisi dei tessuti

1. Scollegare il biochip dal flusso. Scollegare il tubo e controllare al microscopio la confluenza cellulare. A causa dell'aria nella camera inferiore, gli strati cellulari potrebbero apparire sfocati e difficili da visualizzare. A questo punto, il modello è pronto per ulteriori sperimentazioni.
2. Fissazione e colorazione di tessuti in biochip
   1. Lavare le cavità con PBS (+/+) per rimuovere il terreno di coltura cellulare. Pipettare 300 μl di paraformaldeide (PFA) al 4% disciolta in PBS (-/-) nella camera superiore e 200 μl nella camera inferiore e incubare per 10 minuti a RT.
      NOTA: Quando si lavora con prodotti chimici di fissaggio come il PFA, utilizzare una cappa aspirante. Raccogliere e smaltire i rifiuti di conseguenza.
   2. Lavare le camere 3 volte con PBS (+/+). Dopo la fissazione, conservare i biochip a 4 °C o utilizzarli direttamente per la colorazione in immunofluorescenza delle cellule.
   3. Per la permeabilizzazione, pipettare 300 μl di Triton X-100 allo 0,25% in PBS (+/+). Incubare per 30 minuti a RT.
   4. Dopo l'incubazione, lavare entrambe le camere con PBS (+/+) e pipettare 300 μl di albumina sierica bovina (BSA) al 3% in PBS (+/+) in entrambe le camere. Incubare per 1 ora a RT.
   5. Nel frattempo, preparare il pannello anticorpale per la colorazione in immunofluorescenza. Per preparare il pannello anticorpale per la colorazione in immunofluorescenza, è stata installata una provetta con una quantità sufficiente di BSA al 3% per diluire gli anticorpi. Utilizzare 50 μL di diluizioni di anticorpi per ciascuna membrana. Utilizzare un rapporto di diluizione di 1:100 per i pannelli di anticorpi primari e di 1:200 per i pannelli di anticorpi secondari. Inoltre, per il pannello degli anticorpi secondari, preparare DAPI con un rapporto di diluizione di 1:2.000. Per gli anticorpi corrispondenti, vedere (Tabella 1).
   6. Per accedere direttamente alle cellule all'interno del biochip, la lamina di legame deve essere rimossa. Per aprire le camere microfluidiche, eseguire un taglio preciso all'esterno della cavità e rimuovere la lamina di legame. Tagliare la membrana rimuovendo i bordi sigillati al biochip con il bisturi.
      NOTA: Lavorare in modo preciso e accurato durante questa fase per evitare danni alla membrana e lesioni dovute all'affilatura del bisturi.
   7. Dopo aver staccato la membrana dal biochip, dividere la membrana in due pezzi. Raccogliere i pezzi di membrana con una pinzetta e posizionarli su un vetrino microscopico per la colorazione.
   8. Pipettare 50 μl di soluzione anticorpale per pezzo di membrana. Incubare per una notte a 4 °C, al riparo dalla luce.
   9. Dopo l'incubazione, immergere la membrana in 500 μL di PBS (-/-) in una piastra a 24 pozzetti e lavare la membrana 3 volte per 5 minuti ciascuna in PBS (+/+). Dopo il lavaggio, pipettare 50 μL di soluzione di anticorpi secondari e incubare per 1 ora a RT al riparo dalla luce.
   10. Lavare la membrana con PBS (+/+) 3 volte per 5 min ciascuna. Nel frattempo, preparare ed etichettare i vetrini microscopici per l'esperimento. Posizionare una goccia di mezzo di montaggio sul vetrino e posizionare la membrana corrispondente. Ripetere questo passaggio per tutte le membrane. Alla fine, posizionare un'altra goccia del mezzo di montaggio sulla parte superiore della membrana e utilizzare un vetro di copertura. Conservare a 4 °C.

Risultati

Un esame delle alterazioni morfologiche e dell'espressione di proteine marcatrici potrebbe essere eseguito utilizzando la colorazione in immunofluorescenza. Dopo la co-coltura per 14 giorni, i lati vascolare ed epiteliale vengono analizzati per l'espressione dei rispettivi marcatori cellulari. Questo metodo è utile per studiare le interazioni e l'integrità delle componenti vascolari ed epiteliali, che è essenziale per la modellazione della malattia come lettura biologica funzionale correlata all'infezione. La colorazi...

Discussione

Il modello alveolo-on-chip rappresenta un modello tissutale multistrato dell'alveolo umano, che integra tipi cellulari essenziali del tratto respiratorio inferiore, comprese le cellule epiteliali polmonari, le cellule endoteliali e i macrofagi, coltivate in una disposizione organotipica in un ALI con media perfusione del rivestimento endoteliale. Cellule di diversi strati esprimono specifiche proteine marcatrici cellulari come la E-caderina, una molecola di adesione calcio-dipendente delle cellule epiteliali polmonari, c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Cellcounting chamber slides (Countess)	Invitrogen	C10283
Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril	Greiner Bio-One	662 160
Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril	Greiner Bio-One	657 160
Coverslips (24x40mm; #1.5)	Menzel-Gläser	15747592
Eco wipes	Dr. Schuhmacher	00-915-REW10003-01
Eppies 2.0	Sarstedt	72.691
Eppis 0.5	Sarstedt	72.699
Eppis 1.5	Sarstedt	72.690.001
Falcons 15mL	Greiner Bio-One	188 271-TRI
Falcons 50mL	Greiner Bio-One	227 261-TRI
Gauze swab	Noba	PZN 2417767
Gloves Nitril 3000	Meditrade	1280
Microscope slides	Menzel-Gläser	AAAA000001##12E
Multiwell Plates 24 Well, sterile	Greiner Bio-One	662 160
Pasteur pipettes (glass) 150mm	Assistent	40567001
Pasteur pipettes (glass) 230mm	Assistent	40567002
Round-bottom tubes (PS, 5mL)	Falcon	352052
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm	Sarstedt	85.1637.235
Scalpels	Dahlhausen	11.000.00.715
Serological pipettes 10mL	Greiner Bio-One	607 160-TRI
Serological pipettes 25mL	Greiner Bio-One	760 160-TRI
Serological pipettes 2mL	Greiner Bio-One	710 160-TRI
Serological pipettes 50mL	Greiner Bio-One	768 160-TRI
Serological pipettes 5mL	Greiner Bio-One	606 160-TRI
S-Monovette, 7,5ml Z-Gel	Sarstedt	1.1602
S-Monovette, 9,0ml K3E	Sarstedt	02.1066.001
Softasept N	Braun	3887138
T25 flask	Greiner Bio-One	690 960
Tips sterile 10µL	Greiner Bio-One	771 261
Tips sterile 1250µL	Greiner Bio-One	750 261
Tips sterile 300µL	Greiner Bio-One	738 261
Tips unsterile 10µL	Greiner Bio-One	765 290
Tips unsterile 1000µL	Greiner Bio-One	739 291
Tips unsterile 200µL	Greiner Bio-One	686 290
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)	Roth	K343.1
Chemicals
Descosept AF	Dr. Schuhmacher	N-20338
Ethanol 96%	Nordbrand-Nordhausen	410
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa)	Sigma Aldrich	FD4-100MG
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023
Methanol	VWR	20847.295
Saponin	Fluka	47036
Tergazyme	Alconox	1304-1
Cell culture
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG
Dexametason	Sigma-Aldrich	D4902
DPBS (-/-)	Lonza	BE17-516F
DPBS (+/+)	Lonza	BE17-513F
EDTA solution	Sigma-Aldrich	E788S
Endothelial Cell Growth Medium	Promocell	C-22020
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix	Promocell	C-39225
Fetal bovine Serum	Sigma-Aldrich	E2129-10g
H441	ATCC
Human recombinant GM-CSF	Peprotech	300-30
Lidocain	Sigma-Aldrich	L5647-15G
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122 /-163
RPMI	Gibco	72400047
Trypane blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282
Trypsin	Gibco	15090-046
Primary antibodies
Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat)	BD	610252
CD68 (rabbit)	CellSignaling	76437
E-Cadherin (goat)	R&D	AF748
SP-A (mouse)	Abcam	ab51891
Secondary antibodies
AF488 (donkey anti mouse)	Invitrogen	R37114
AF647 (donkey anti mouse)	invitrogen	A31571
AF647 (donkey anti rabbit)	Invitrogen	A31573
Cy3 (donkey anti goat)	jackson research	705-165-147
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
Microfluidic
Chip	Dynamic 42	BC002
Male Luer Lock (small)	ChipShop	09-0503-0270-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, green	Microfluidic chipshop	09-0558-0336-11
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque	Microfluidic chipshop	09-0556-0336-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, red	Microfluidic chipshop	09-0557-0336-10
Plugs	Cole Parmer	GZ-45555-56
Reservoir 4.5mL	ChipShop	16-0613-0233-09
Tubing	Dynamic 42	ST001
Equipment
Autoclave	Tuttnauer	5075 ELV
Centrifuge	Eppendorf	5424
CO2 Incubator	Heracell	150i
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227
Flowcytometer	BD	FACS Canto II
Freezer (-20 °C)	Liebherr	LCexv 4010
Freezer (-80 °C)	Heraeus	Herafreeze HFU 686
Fridge	Liebherr	LCexv 4010
Heraeus Multifuge	Thermo Scientific	X3R
Microscope	Leica	DM IL LED
Orbital shaker	Heidolph	Reax2000
Peristaltic pump	REGLO Digital MS-4/12	ISM597D
Pipettes 10µL	Eppendorf Research plus	3123000020
Pipettes 100µL	Eppendorf Research plus	3123000047
Pipettes 1000µL	Eppendorf Research plus	3123000063
Pipettes 2.5µL	Eppendorf Research plus	3123000012
Pipettes 20µL	Eppendorf Research plus	3123000039
Pipettes 200µL	Eppendorf Research plus	3123000055
Scale	Sartorius	6101
Scale	Sartorius	TE1245
Sterile bench	Kojair	Biowizard SL-130
Waterbath	Julabo	SW-20C
Fluorescence Microscope Setup
Apotome.2	Zeiss
Illumination device	Zeiss	HXP 120 C
Microscope	Zeiss	Axio Observer 5
Optical Sectioning	Zeiss	ApoTome
Power Supply Microscope	Zeiss	Eplax Vp232
Software
ZEN Blue Edition	Zeiss