Иммунокомпетентная модель альвеолы на чипе для изучения иммунных реакций альвеолярной слизистой оболочки

Резюме

Модели легких на чипе превосходят традиционные 2D-культуры, имитируя воздушно-жидкостную границу раздела и перфузию эндотелиальных клеток, имитируя кровоток и обмен питательных веществ, что имеет решающее значение для исследований физиологии легких. Это повышает актуальность исследований легких, предлагая динамичную, физиологически точную среду для улучшения понимания и лечения респираторных инфекций.

Аннотация

Мы представляем передовую иммунокомпетентную модель легкого на чипе, предназначенную для воспроизведения альвеолярной структуры и функции человека. В этой инновационной модели используется микрофлюидно-перфузионный биочип, который поддерживает воздушно-жидкостную границу, имитирующую окружающую среду в альвеолах человека. Тканевая инженерия используется для интеграции ключевых клеточных компонентов, включая эндотелиальные клетки, макрофаги и эпителиальные клетки, для создания репрезентативной тканевой модели альвеолы. Модель облегчает углубленное изучение иммунных реакций слизистых оболочек на различные патогены, включая вирусы, бактерии и грибки, тем самым улучшая наше понимание иммунитета легких. Основная цель этого протокола состоит в том, чтобы предоставить подробную информацию для создания этой модели альвеолы на чипе в качестве надежной платформы in vitro для изучения инфекций, позволяющей исследователям внимательно наблюдать и анализировать сложные взаимодействия между патогенами и иммунной системой хозяина в легочной среде. Это достигается за счет применения микрофлюидных методов для моделирования ключевых физиологических состояний альвеол человека, включая кровоток и биомеханическую стимуляцию эндотелиальных клеток, а также поддержания границы раздела воздух-жидкость, имеющего решающее значение для реалистичного воздействия воздуха на эпителиальные клетки. Модельная система совместима с рядом стандартизированных анализов, таких как иммунофлуоресцентное окрашивание, профилирование цитокинов и анализ колониеобразующих единиц (КОЕ)/бляшек, что позволяет получить всестороннее представление об иммунной динамике во время инфекции. Альвеола-он-чип состоит из основных типов клеток, включая эпителиальные клетки дистального отдела легких человека (H441) и эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs), разделенные пористыми мембранами из полиэтилентерефталата (ПЭТ), при этом первичные макрофаги, полученные из моноцитов, стратегически расположены между эпителиальным и эндотелиальным слоями. Тканевая модель расширяет возможности препарирования и анализа нюансов факторов, участвующих в легочных иммунных реакциях in vitro. Являясь ценным инструментом, он должен способствовать развитию исследований легких, обеспечивая более точную и динамичную модель in vitro для изучения патогенеза респираторных инфекций и тестирования потенциальных терапевтических вмешательств.

Введение

Легкое человека играет замечательную роль в дыхании и иммунной защите, со сложными взаимодействиями между иммунными реакциями альвеолярной слизистой оболочки¹. Способность альвеол создавать эффективный иммунный ответ жизненно важна для предотвращения инфекций легких и обеспечения здоровья легких. Поскольку легкие постоянно подвергаются воздействию широкого спектра потенциальных рисков, включая бактерии, вирусы, грибки, аллергии и твердые частицы, понимание сложностей иммунных реакций слизистых оболочек альвеол имеет решающее значение для выявления механизмов респираторных инфекций, воспалительных заболеваний и лечения легочных^{заболеваний.}

Для изучения инфекций и воспалительных процессов дыхательных путей in vitro требуются модели, которые могли бы точно имитировать альвеолярную среду и иммунные реакции. Двухмерные клеточные культуры и модули животных на протяжении десятилетий использовались в качестве важных инструментов для биомедицинских исследований иммунного ответа легких. Тем не менее, они часто имеют ограничения в своем трансляционном потенциале в человеческих ситуациях. Модели «легкое на чипе» могут способствовать заполнению пробела между традиционными моделями in vitro и in vivo и обеспечить новый подход к изучению специфических иммунных реакций человека ^2,3. Модели «легкое на чипе» могут имитировать границу раздела воздух-жидкость, которая необходима клеткам легких для повторения физиологических условий дыхательных путей и разработки более точной и надежной модели ткани. Этот метод культивирования позволяет точно исследовать дифференцировку, функционирование и реакцию клеток на лекарства или стимулы, связанные с заболеванием, in vitro 2.

В этом исследовании мы представляем микрофлюидную модель альвеолы человека в качестве эффективного инструмента для повторения альвеолярной среды человека путем применения перфузии для имитации кровотока и биомеханической стимуляции эндотелиальных клеток, а также включения воздушно-жидкостного интерфейса с эпителиальными клетками, подвергшимися воздействию воздушной фазы⁴. Мы разработали микрофлюидную перфузную альвеолу на кристалле, которая имитирует физическую структуру и биологические взаимодействия альвеолы человека, уделяя особое внимание границе раздела воздух-жидкость. Этот интерфейс играет решающую роль в дифференцировке эпителиальных клеток дыхательных путей, что имеет важное значение для точного моделирования легочной среды. В модели используются эпителиальные клетки дистального отдела легких человека (H441) и эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs), разделенные пористыми мембранами из полиэтилентерефталата (ПЭТ), с первичными макрофагами, полученными из моноцитов, расположенными между слоями клеток. Эта установка воспроизводит сложное клеточное расположение альвеолы и имеет решающее значение для точного моделирования границы раздела воздух-жидкость, которая является важным фактором физиологической функции легочной ткани.

Обоснование разработки модели распространяется на интеграцию как циркулирующих, так и тканевых резидентных иммунных клеток. Этот подход предназначен для точной имитации воспалительной реакции хозяина на респираторные инфекции человека, обеспечивая динамическую среду для изучения взаимодействий патогена и хозяина. Присутствие макрофагов позволяет исследовать непосредственные иммунные реакции и их взаимодействие с патогенами, отражая первую линию защиты от респираторных инфекций. Кроме того, конструкция платформы биочипа способствует удобному и точному манипулированию как биофизическими, так и биохимическими сигналами, что имеет решающее значение для репликации функции альвеол in vitro. Такая гибкость играет важную роль в анализе факторов, способствующих инфицированию человека, позволяя исследователям корректировать условия в соответствии с различными состояниями заболевания или тестировать потенциальные терапевтические вмешательства. Совместимость платформы с несколькими технологиями считывания, включая передовую микроскопию, микробиологический анализ и биохимический анализ сточных вод, повышает ее полезность. Эти возможности позволяют всесторонне оценить реакцию тканей на инфекции, включая оценку клеточного поведения, пролиферации патогенов и эффективности иммунных реакций.

Мы представляем подробный протокол и методы создания и использования модели альвеолы на чипе человека, ориентированной на репликацию границы раздела воздух-жидкость и интеграцию иммунных клеток для изучения инфекций человека in vitro.

протокол

Клетки HUVEC выделяют из пуповины и используют до пассажа 4. Первичные моноциты выделяются от здоровых доноров из цельной крови. Исследование было одобрено комитетом по этике Университетской больницы Йены, Йена, Германия (3939-12/13). Согласно Хельсинкской декларации, все лица, сдающие клетки для исследования, дали свое информированное согласие.

1. День 1: Подготовка биочипа

1. Биочипы доступны в различных размерах и моделях. Для экспериментов здесь используйте модель BC002. Поместите биочип в стеклянную чашку Петри, наполните чашку и промойте все полости стерильным 70% этанолом (EthOH). Выдерживать 45 минут при комнатной температуре. После этого промойте полости 2 раза стерильным ddH₂O. Удалите ddH₂O.
2. Покройте мембрану биочипа обеих полостей стерильным раствором коллагена для внутривенного введения (0,5 мг/мл в 0,5 мМ уксусной кислоты; используйте концентрацию 1:100 в фосфатном буферном физрастворе Дульбекко, содержащем магний и кальций PBS (+/+)) путем осторожного промывания раствора коллагена внутривенно через обе полости с помощью пипетки объемом 1000 мкл с синими наконечниками. Инкубировать в течение 15 минут при 37 °C и 5%_CO2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать пипетку объемом 1 000 мкл с наконечниками с синим фильтром (P1000) на протяжении всего протокола. Диаметр отверстия наконечника фильтра полностью закрывает отверстие портов, соединяющих каналы, что позволяет избежать попадания пузырьков воздуха внутрь чипа.
3. После 30 минут инкубации 2 раза промойте нижнюю и верхнюю камеры стерильным PBS (+/+) для вымывания остатков коллагена и уксусной кислоты.
4. Приготовьте среду EC, добавив 1:100 (v/v) пенициллин/стрептомицин (10 000 ЕД/мл). Заполните верхнюю камеру каждой полости 250 μL EC-среды, а нижнюю камеру 150 μL EC-среды.
5. Соберите HUVEC из фляги T25: Промойте 5 мл фосфатного буферного физиологического раствора Дульбекко без магния и кальция PBS (-/-), добавьте 1 мл 0,25% трипсина + 1 мМ ЭДТА в PBS (-/-) и инкубируйте в течение 3 минут при 37 °C. Остановите активность трипсина, добавив 5 мл PBS (+/+) + 5% FCS, и центрифугируйте при 350 x g в течение 5 мин при комнатной температуре (RT) в коническую пробирку объемом 50 мл. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл EC-среды.
6. Используйте последовательное разведение в соотношении 1:10 при подсчете клеток. Добавьте 10 мкл ресуспендированной клеточной гранулы в 90 мкл клеточной среды. Тщательно комбинируйте образцы. Используйте микроцентрифужную пробирку с 10 μл трипанового синего пятна. Раствор клетки разбавить трипановым синим (1:1) с помощью предметных стекол камеры подсчета клеток. Подсчитывайте ячейки вручную с помощью камеры Нейбауэра или с помощью автоматического счетчика ячеек. Определите количество клеток и отрегулируйте концентрацию с точностью до 0,4 x 10⁶ клеток на 200 μл.
7. Замените среду эндотелиальных клеток в верхней камере биочипа на 200 мкл EC-среды, содержащей взвешенные HUVECs. Делайте пипетку аккуратно, чтобы избежать образования пузырьков воздуха в каналах или камерах. Поместите стеклянную чашку Петри с биочипами при температуре 37 °C и 5%_CO2.

2. День 2: Проверка клеточного слоя

1. На 2-й день визуально проверьте слияние клеточного слоя HUVEC в верхней камере. Проведите обмен среды в верхней камере с 300 μл EC среды. Делайте пипетку аккуратно, чтобы избежать отслоения клеток от мембраны. Осуществляйте медиаобмен ежедневно после 24 часов. Поместите стеклянную чашку Петри с биочипами обратно при температуре 37 °C и 5%_CO2.

3. День 3: Подготовка нижней камеры

1. Визуально проверьте слияние слоя эндотелиальных клеток. На этом этапе определите наличие сливающегося слоя и морфологию, похожую на булыжник (Рисунок 1). Проведите обмен среды в верхней камере с 300 μл EC среды.
2. Далее подготовьте нижнюю камеру для засеивания клеток, образующих эпителиальный слой. Аккуратно промойте нижнюю камеру 150 μL среды RPMI (добавьте 1:100 (v/v) пенициллин/стрептомицин (10 000 Ед/мл), 5% эмбриональную сыворотку коровы, 1 μМ дексаметазона).
3. Для нижней камеры затравка 0,5 x 10⁶ ячеек H441 суспендирована в 200 мкл среды RPMI (RPMI) на полость.
4. Забор клеток H441
   1. Промойте ячейки 5 мл PBS (-/-) один раз. Добавьте 2 мл 0,25% трипсина + 1 мМ ЭДТА в PBS (-/-).
   2. Инкубируйте клетки в течение 5 минут при 37 °C и 5%_CO2. Время инкубации варьируется в зависимости от слияния несушки. В течение 5-7 мин клетки должны полностью отделиться.
   3. Остановите активность трипсина с помощью 10 мл PBS (+/+) + 5% FBS, соберите клетки и центрифугируйте при 200 x g в течение 4 минут.
   4. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 1 мл RPMI и подсчитайте.
   5. Затравите 0,5 х 10^{по 6} клеток в камере, аккуратно пипетируя раствор клеток в нижнюю камеру. Закройте все порты и переверните биочип вверх дном, чтобы клетки могли прикрепиться к мембране ПЭТ. Держите биочип вверх дном и инкубируйте в течение ночи в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C и 5%_CO2.

4. День 4 - День 7: Поддержание клеток и сбор моноцитов

1. Выполняйте ежедневный среднесрочный обмен в верхней и нижней камере. Для верхней камеры выполните замену среды на 300 мкл EC-среды.
2. Используйте 200 мкл RPMI+ (среда RPMI плюс 1:100 (v/v) пенициллин/стрептомицин (10 000 ЕД/мл), 10 нг/мл GM-CSF, 10% аутологичной человеческой сыворотки, 1 мкМ дексаметазон) для нижней камеры. На 7-й день промойте нижнюю камеру препаратом RPMI+, чтобы подготовить полость для посева моноцитов.
3. Затравка 0,1 х 10⁶ моноцитов, взвешенных в 200 мкл RPMI+ в нижней камере.
4. Заготовка моноцитов
   1. Промойте клетки 1 мл PBS (-/-) и инкубируйте в течение 7 мин при 37 °C в предварительно подогретом PBS (-/-), содержащем 4 мг/мл лидокаина + 5 мМ ЭДТА при 37 °C и 5%_CO2.
   2. Соберите клетки и центрифугируйте при 350 x g в течение 7 минут, повторно суспендируйте клетки в 1 мл RPMI+ и подсчитайте. Поместите порты биочипа вниз, чтобы клетки прикрепились к мембране.

5. День 8: Перфузия биочипа

1. На этом этапе убедитесь, что биочипы готовы к подключению к потоку и перфузии. Перед началом перфузии подготовьте пустой инкубатор и поместите внутрь перистальтический насос.
2. Перфузия биочипов
   1. Перед тем, как прикрепить стерилизованную трубку к биочипу, промойте трубку 200 μL PBS (+/+), а затем 200 μL EC-среды. Трубка имеет внутренний диаметр 0,5 мм, состоящий из более длинных (20 см) и более коротких (12 см) сторон, разделенных двумя перистальтическими пробками насоса. Отложите трубки в сторону и подготовьте резервуары для среды.
   2. Проведите обмен сред в верхней и нижней камерах, промыв их соответствующей свежеприготовленной средой для культивирования клеток.
   3. Вставьте резервуар на выходной стороне биочипа и подсоедините резервуар с трубкой к входному отверстию биочипа (рис. 2). Подсоедините трубку к резервуару и биочипу так, чтобы между резервуаром и биочипом была круговая перфузия среды.
   4. Как только все будет подключено к портам, заполните резервуар 500 μл EC среды. Соедините биочип с трубкой на перфузии с расходом 21 мкл/мин (рис. 2). Внимательно наблюдайте в течение первых 15 минут перфузии на предмет введения пузырьков. Проводите обмен медиумов ежедневно в обеих камерах.

6. День 9 - День 11: Создание границы раздела воздух-жидкость

1. Остановите перфузию, опорожните резервуары и наполните их свежеприготовленной средой под стерильным безопасным шкафом. Нанесите пипеткой 500 мкл EC-среды в резервуары и аккуратно промойте нижнюю камеру 200 мкл RPMI+. Начните перфузию снова со скоростью перфузии 21 μл/мин.
2. Воздушно-жидкостный интерфейс (ALI)
   1. Устанавливайте ALI с 12-го дня и до конца эксперимента (14-й день). Во время культивирования ALI подвергайте эпителиальные клетки воздействию воздуха.
   2. Чтобы получить культуру ОПЛ, приготовьте новую сосудистую среду EC (добавьте 1:100 (v/v) пенициллин/стрептомицин (10 000 ЕД/мл), 10 нг/мл GM-CSF, 20% аутологичной сыворотки человека, 1μМ дексаметазон) для поддержания всех типов клеток в чипе. На этом этапе среда содержит более высокую концентрацию АС (20%).
   3. Откройте пробки в нижней камере под стерильным защитным шкафом и осторожно впитайте среду до тех пор, пока не станет виден пузырь воздуха, как показано на рисунке 3. Убедитесь, что вся жидкость из канала и камеры удалена, и осторожно закройте порты.
   4. Заполните резервуары средой EC (-/-) и продолжайте перфузионную культуру с расходом 21 μл/мин. Замените среду только в верхней камере до 14-го дня и держите эпителиальные клетки в нижней камере только воздухом.

7. День 14: Забор и анализ тканей

1. Отсоедините биочип от потока. Закупорьте трубку и проверьте на микроскопе слияние клеток. Из-за воздуха в нижней камере клеточные слои могут казаться нечеткими и трудными для визуализации. На этом этапе модель готова к дальнейшим экспериментам.
2. Фиксация и окрашивание ткани в биочипе
   1. Промойте полости PBS (+/+) для удаления среды клеточной культуры. Пипетку 300 мкл 4% параформальдегида (PFA) растворяют в PBS (-/-) в верхнюю камеру и 200 мкл в нижней камере и инкубируют в течение 10 мин при РТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с фиксирующими химическими веществами, такими как PFA, используйте вытяжной шкаф. Соберите и утилизируйте отходы соответствующим образом.
   2. Промойте камеры 3 раза с PBS (+/+). После фиксации храните биочипы при температуре 4 °C или используйте их непосредственно для иммунофлуоресцентного окрашивания клеток.
   3. Для пермеабилизации пипетку дозируйте 300 мкл 0,25% Triton X-100 в PBS (+/+). Инкубировать в течение 30 минут при RT.
   4. После инкубации промойте обе камеры PBS (+/+) и нанесите пипеткой 300 мкл 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS (+/+) в обеих камерах. Инкубировать в течение 1 ч при РТ.
   5. Тем временем подготовьте панель антител для иммунофлуоресцентного окрашивания. Для подготовки панели антител к иммунофлуоресцентному окрашиванию устанавливали пробирку с достаточным количеством 3% БСА для разбавления антител. Используйте 50 мкл разведений антител для каждой мембраны. Используйте коэффициент разведения 1:100 для панелей первичных антител и 1:200 для панелей вторичных антител. Кроме того, для вторичной панели антител готовят DAPI в соотношении разведения 1:2000. Соответствующие антитела см. в таблице 1.
   6. Чтобы получить прямой доступ к клеткам внутри биочипа, необходимо снять связующую фольгу. Чтобы открыть микрофлюидные камеры, сделайте точный разрез по внешней стороне полости и снимите связующую фольгу. Вырежьте мембрану, удалив скальпелем края, припаянные к биочипу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте точно и аккуратно на этом этапе, чтобы избежать повреждения мембраны и травм из-за остроты скальпеля.
   7. Отсоединив мембрану от биочипа, разделите мембрану на две части. Соберите кусочки мембраны пинцетом и поместите их на микроскопическое предметное стекло для окрашивания.
   8. Пипетка 50 мкл раствора антитела на кусочек мембраны. Выдерживать в течение ночи при температуре 4 °C, в защищенном от света месте.
   9. После инкубации поместите мембрану в 500 мкл PBS (-/-) в 24-луночную пластину и промойте мембрану 3 раза в течение 5 минут в PBS (+/+). После промывки пипетку пипетку 50 мкл раствора вторичного антитела и инкубировать в течение 1 ч при РТ в защищенном от света месте.
   10. Промойте мембрану PBS (+/+) 3 раза в течение 5 минут каждая. Тем временем подготовьте и промаркируйте микроскопические предметные стекла для эксперимента. Поместите каплю монтажного материала на предметное стекло и установите соответствующую мембрану. Повторите этот шаг для всех мембран. В конце поместите еще одну каплю монтажного материала на верхнюю часть мембраны и используйте покровное стекло. Хранить при температуре 4 °C.

Результаты

Изучение морфологических изменений и экспрессии маркерных белков может быть выполнено с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания. После совместного культивирования в течение 14 дней сосудистая и эпителиальная стороны анализируются на экспрессию соответствующих клеточных маркеро?...

Обсуждение

Модель альвеолы на чипе представляет собой многослойную тканевую модель альвеолы человека, объединяющую основные типы клеток нижних дыхательных путей, включая эпителиальные клетки легких, эндотелиальные клетки и макрофаги, культивируемые в органотипической компоновке в ОПЛ со сред?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Cellcounting chamber slides (Countess)	Invitrogen	C10283
Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril	Greiner Bio-One	662 160
Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril	Greiner Bio-One	657 160
Coverslips (24x40mm; #1.5)	Menzel-Gläser	15747592
Eco wipes	Dr. Schuhmacher	00-915-REW10003-01
Eppies 2.0	Sarstedt	72.691
Eppis 0.5	Sarstedt	72.699
Eppis 1.5	Sarstedt	72.690.001
Falcons 15mL	Greiner Bio-One	188 271-TRI
Falcons 50mL	Greiner Bio-One	227 261-TRI
Gauze swab	Noba	PZN 2417767
Gloves Nitril 3000	Meditrade	1280
Microscope slides	Menzel-Gläser	AAAA000001##12E
Multiwell Plates 24 Well, sterile	Greiner Bio-One	662 160
Pasteur pipettes (glass) 150mm	Assistent	40567001
Pasteur pipettes (glass) 230mm	Assistent	40567002
Round-bottom tubes (PS, 5mL)	Falcon	352052
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm	Sarstedt	85.1637.235
Scalpels	Dahlhausen	11.000.00.715
Serological pipettes 10mL	Greiner Bio-One	607 160-TRI
Serological pipettes 25mL	Greiner Bio-One	760 160-TRI
Serological pipettes 2mL	Greiner Bio-One	710 160-TRI
Serological pipettes 50mL	Greiner Bio-One	768 160-TRI
Serological pipettes 5mL	Greiner Bio-One	606 160-TRI
S-Monovette, 7,5ml Z-Gel	Sarstedt	1.1602
S-Monovette, 9,0ml K3E	Sarstedt	02.1066.001
Softasept N	Braun	3887138
T25 flask	Greiner Bio-One	690 960
Tips sterile 10µL	Greiner Bio-One	771 261
Tips sterile 1250µL	Greiner Bio-One	750 261
Tips sterile 300µL	Greiner Bio-One	738 261
Tips unsterile 10µL	Greiner Bio-One	765 290
Tips unsterile 1000µL	Greiner Bio-One	739 291
Tips unsterile 200µL	Greiner Bio-One	686 290
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)	Roth	K343.1
Chemicals
Descosept AF	Dr. Schuhmacher	N-20338
Ethanol 96%	Nordbrand-Nordhausen	410
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa)	Sigma Aldrich	FD4-100MG
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023
Methanol	VWR	20847.295
Saponin	Fluka	47036
Tergazyme	Alconox	1304-1
Cell culture
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG
Dexametason	Sigma-Aldrich	D4902
DPBS (-/-)	Lonza	BE17-516F
DPBS (+/+)	Lonza	BE17-513F
EDTA solution	Sigma-Aldrich	E788S
Endothelial Cell Growth Medium	Promocell	C-22020
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix	Promocell	C-39225
Fetal bovine Serum	Sigma-Aldrich	E2129-10g
H441	ATCC
Human recombinant GM-CSF	Peprotech	300-30
Lidocain	Sigma-Aldrich	L5647-15G
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122 /-163
RPMI	Gibco	72400047
Trypane blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282
Trypsin	Gibco	15090-046
Primary antibodies
Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat)	BD	610252
CD68 (rabbit)	CellSignaling	76437
E-Cadherin (goat)	R&D	AF748
SP-A (mouse)	Abcam	ab51891
Secondary antibodies
AF488 (donkey anti mouse)	Invitrogen	R37114
AF647 (donkey anti mouse)	invitrogen	A31571
AF647 (donkey anti rabbit)	Invitrogen	A31573
Cy3 (donkey anti goat)	jackson research	705-165-147
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
Microfluidic
Chip	Dynamic 42	BC002
Male Luer Lock (small)	ChipShop	09-0503-0270-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, green	Microfluidic chipshop	09-0558-0336-11
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque	Microfluidic chipshop	09-0556-0336-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, red	Microfluidic chipshop	09-0557-0336-10
Plugs	Cole Parmer	GZ-45555-56
Reservoir 4.5mL	ChipShop	16-0613-0233-09
Tubing	Dynamic 42	ST001
Equipment
Autoclave	Tuttnauer	5075 ELV
Centrifuge	Eppendorf	5424
CO2 Incubator	Heracell	150i
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227
Flowcytometer	BD	FACS Canto II
Freezer (-20 °C)	Liebherr	LCexv 4010
Freezer (-80 °C)	Heraeus	Herafreeze HFU 686
Fridge	Liebherr	LCexv 4010
Heraeus Multifuge	Thermo Scientific	X3R
Microscope	Leica	DM IL LED
Orbital shaker	Heidolph	Reax2000
Peristaltic pump	REGLO Digital MS-4/12	ISM597D
Pipettes 10µL	Eppendorf Research plus	3123000020
Pipettes 100µL	Eppendorf Research plus	3123000047
Pipettes 1000µL	Eppendorf Research plus	3123000063
Pipettes 2.5µL	Eppendorf Research plus	3123000012
Pipettes 20µL	Eppendorf Research plus	3123000039
Pipettes 200µL	Eppendorf Research plus	3123000055
Scale	Sartorius	6101
Scale	Sartorius	TE1245
Sterile bench	Kojair	Biowizard SL-130
Waterbath	Julabo	SW-20C
Fluorescence Microscope Setup
Apotome.2	Zeiss
Illumination device	Zeiss	HXP 120 C
Microscope	Zeiss	Axio Observer 5
Optical Sectioning	Zeiss	ApoTome
Power Supply Microscope	Zeiss	Eplax Vp232
Software
ZEN Blue Edition	Zeiss