Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نماذج الرئة على رقاقة تتجاوز الثقافات التقليدية 2D من خلال محاكاة واجهة الهواء السائل ونضح الخلايا البطانية، ومحاكاة تدفق الدم وتبادل المغذيات حاسمة لدراسات فسيولوجيا الرئة. هذا يعزز أهمية أبحاث الرئة ، ويوفر بيئة ديناميكية ودقيقة من الناحية الفسيولوجية لتعزيز فهم وعلاج التهابات الجهاز التنفسي.

Abstract

نقدم نموذجا متقدما للرئة على الرقاقة ذات الكفاءة المناعية مصمما لتكرار البنية السنخية البشرية ووظيفتها. يستخدم هذا النموذج المبتكر رقاقة حيوية ذات موائع دقيقة تدعم واجهة الهواء والسائل التي تحاكي البيئة في الحويصلات الهوائية البشرية. تستخدم هندسة الأنسجة لدمج المكونات الخلوية الرئيسية ، بما في ذلك الخلايا البطانية والبلاعم والخلايا الظهارية ، لإنشاء نموذج نسيجي تمثيلي للحويصلات الهوائية. يسهل النموذج إجراء فحوصات متعمقة للاستجابات المناعية المخاطية لمسببات الأمراض المختلفة ، بما في ذلك الفيروسات والبكتيريا والفطريات ، وبالتالي تعزيز فهمنا لمناعة الرئة. الهدف الأساسي من هذا البروتوكول هو توفير تفاصيل لإنشاء نموذج الحويصلات الهوائية على الرقاقة كمنصة قوية في المختبر لدراسات العدوى ، مما يمكن الباحثين من مراقبة وتحليل التفاعلات المعقدة بين مسببات الأمراض والجهاز المناعي للمضيف داخل البيئة الرئوية عن كثب. يتم تحقيق ذلك من خلال تطبيق التقنيات القائمة على الموائع الدقيقة لمحاكاة الظروف الفسيولوجية الرئيسية للحويصلات الهوائية البشرية ، بما في ذلك تدفق الدم والتحفيز الميكانيكي الحيوي للخلايا البطانية ، إلى جانب الحفاظ على واجهة الهواء والسائل الضرورية للتعرض الواقعي للخلايا الظهارية للهواء. يتوافق النظام النموذجي مع مجموعة من المقايسات الموحدة ، مثل تلطيخ التألق المناعي ، وتوصيف السيتوكين ، وتحليل وحدة تكوين المستعمرات (CFU) / اللويحات ، مما يسمح برؤى شاملة لديناميكيات المناعة أثناء العدوى. تتكون الحويصلات الهوائية على الرقاقة من أنواع الخلايا الأساسية ، بما في ذلك الخلايا الظهارية الرئوية البشرية البعيدة (H441) والخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs) مفصولة بأغشية البولي إيثيلين تيريفثاليت المسامية (PET) ، مع وجود بلاعم أولية مشتقة من الخلايا الوحيدة في وضع استراتيجي بين الطبقات الظهارية والبطانية. يعزز نموذج الأنسجة القدرة على تشريح وتحليل العوامل الدقيقة التي تنطوي عليها الاستجابات المناعية الرئوية في المختبر. كأداة قيمة ، يجب أن تساهم في تقدم أبحاث الرئة ، وتوفير نموذج أكثر دقة وديناميكية في المختبر لدراسة التسبب في التهابات الجهاز التنفسي واختبار التدخلات العلاجية المحتملة.

Introduction

تلعب الرئة البشرية دورا ملحوظا في التنفس والدفاع المناعي ، مع تفاعلات معقدة بين الاستجابات المناعية للغشاء المخاطي السنخي1. تعد قدرة الحويصلات الهوائية على خلق استجابة مناعية فعالة أمرا حيويا للوقاية من التهابات الرئة وتأمين الصحة الرئوية. نظرا لأن الرئتين تتعرض باستمرار لمجموعة واسعة من المخاطر المحتملة ، بما في ذلك البكتيريا والفيروسات والفطريات والحساسية والجسيمات ، فإن فهم تعقيدات الاستجابات المناعية المخاطية السنخية أمر بالغ الأهمية لاكتشاف الآليات الكامنة وراء التهابات الجهاز التنفسي والاضطرابات الالتهابية وعلاج الأمراض الرئوية1.

لدراسة العدوى والعمليات المرتبطة بالالتهاب في الجهاز التنفسي في المختبر ، هناك حاجة إلى نماذج يمكن أن تحاكي بأمانة الوسط السنخي والاستجابات المناعية. وقد استخدمت 2D ثقافة الخلايا والوحدات الحيوانية لعقود من الزمن كأدوات أساسية للبحوث الطبية الحيوية على الاستجابة المناعية للرئة. ومع ذلك ، غالبا ما يكون لديهم قيود في إمكاناتهم الانتقالية للمواقف البشرية. يمكن أن تساهم نماذج الرئة على الرقاقة في سد الفجوة بين النماذج التقليدية في المختبر وفي الجسم الحي وتوفر نهجا جديدا لدراسة الاستجابات المناعية الخاصة بالإنسان 2,3. يمكن لنماذج الرئة على الرقاقة أن تحاكي واجهة الهواء والسائل ، وهو أمر مطلوب لخلايا الرئة لتلخيص الظروف الفسيولوجية للجهاز التنفسي وتطوير نموذج أنسجة أكثر دقة وقوة. تتيح تقنية المزرعة هذه فحصا دقيقا لتمايز الخلايا وعملها واستجاباتها للأدوية أو المحفزات المرتبطة بالأمراض في المختبر2.

في هذه الدراسة ، نقدم نموذجا قائما على الموائع الدقيقة للحويصلات الهوائية البشرية كأداة فعالة لتلخيص الوسط السنخي البشري من خلال تطبيق التروية لتقليد تدفق الدم والتحفيز الميكانيكي الحيوي للخلايا البطانية ودمج واجهة الهواء السائل مع الخلايا الظهارية المعرضة نحو مرحلة الهواء4. لقد قمنا بتطوير الحويصلات الهوائية ذات الموائع الدقيقة على الرقاقة التي تحاكي البنية الفيزيائية والتفاعلات البيولوجية للحويصلات الهوائية البشرية ، مع التركيز بشكل خاص على واجهة الهواء والسائل. تلعب هذه الواجهة دورا حاسما في تمايز الخلايا الظهارية التنفسية ، وهو أمر ضروري لنمذجة البيئة الرئوية بدقة. يستخدم النموذج الخلايا الظهارية الرئوية البشرية البعيدة (H441) والخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs) ، مفصولة بأغشية البولي إيثيلين تيريفثاليت المسامية (PET) ، مع وضع البلاعم الأولية المشتقة من الخلايا الوحيدة بين طبقات الخلايا. يكرر هذا الإعداد الترتيب الخلوي المعقد للحويصلات الهوائية وهو أمر بالغ الأهمية لمحاكاة واجهة الهواء والسائل بدقة ، وهو عامل مهم في الوظيفة الفسيولوجية لأنسجة الرئة.

يمتد الأساس المنطقي وراء تطوير النموذج إلى دمج كل من الخلايا المناعية المنتشرة والمقيمة في الأنسجة. تم تصميم هذا النهج لمحاكاة استجابة المضيف الالتهابية بدقة لالتهابات الجهاز التنفسي البشرية ، مما يوفر بيئة ديناميكية لدراسة التفاعلات بين العامل الممرض والمضيف. يسمح وجود الضامة بفحص الاستجابات المناعية الفورية وتفاعلها مع مسببات الأمراض ، مما يعكس خط الدفاع الأول ضد التهابات الجهاز التنفسي. علاوة على ذلك ، يسهل تصميم منصة الرقاقة الحيوية المعالجة المريحة والدقيقة لكل من الإشارات الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية ، وهو أمر بالغ الأهمية لتكرار وظيفة الحويصلات الهوائية في المختبر. هذه المرونة مفيدة في تشريح العوامل المساهمة في العدوى البشرية ، مما يمكن الباحثين من تعديل الظروف لتعكس حالات المرض المختلفة أو لاختبار التدخلات العلاجية المحتملة. إن توافق المنصة مع تقنيات القراءة المتعددة ، بما في ذلك الفحص المجهري المتقدم والتحليلات الميكروبيولوجية وتحليل النفايات السائلة الكيميائية الحيوية ، يعزز فائدتها. تسمح هذه القدرات بإجراء تقييم شامل لاستجابة الأنسجة للعدوى ، بما في ذلك تقييم السلوك الخلوي ، وانتشار مسببات الأمراض ، وفعالية الاستجابات المناعية.

نقدم بروتوكولا وتقنيات مفصلة لإنشاء واستخدام نموذج الحويصلات الهوائية البشرية على الرقاقة الذي يركز على تكرار واجهة الهواء السائل ودمج الخلايا المناعية لدراسة العدوى البشرية في المختبر.

Protocol

يتم عزل خلايا HUVEC من الحبال السرية وتستخدم حتى الممر 4. يتم عزل الخلايا الوحيدة الأولية من المتبرعين الأصحاء من الدم الكامل. تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى جامعة يينا ، يينا ، ألمانيا (3939-12 / 13). وفقا لإعلان هلسنكي ، أعطى جميع الأفراد الذين يتبرعون بالخلايا للدراسة موافقتهم المستنيرة.

1. اليوم الأول: تحضير الرقاقة الحيوية

  1. الرقائق الحيوية متوفرة بأحجام ونماذج مختلفة. للتجارب هنا ، استخدم النموذج BC002. ضع الرقاقة الحيوية في طبق بتري زجاجي ، واملأ الطبق ، واغسل جميع التجاويف بالإيثانول المعقم بنسبة 70٪ (EthOH). احتضان لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بمسح التجاويف 2x باستخدام ddH2O. قم بإزالة ddH2O.
  2. قم بتغطية غشاء الرقاقة الحيوية لكلا التجويفين بمحلول وريدي معقم للكولاجين (0.5 مجم / مل في 0.5 مللي متر من حمض الأسيتيك ؛ استخدم تركيز 1: 100 في محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco يحتوي على المغنيسيوم والكالسيوم PBS (+/+)) عن طريق شطف محلول الكولاجين الوريدي برفق عبر كلا التجويفين باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر مع أطراف زرقاء. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    ملاحظة: يوصى باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر مع أطراف مرشح أزرق (P1000) في جميع أنحاء البروتوكول بأكمله. يغطي قطر فتحة طرف المرشح تماما فتح المنافذ التي تربط القنوات ، مما يتجنب إدخال فقاعات الهواء في الشريحة.
  3. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، اغسل الغرف السفلية والعلوية 2x باستخدام برنامج تلفزيوني معقم (+/+) لطرد الكولاجين المتبقي وحمض الأسيتيك.
  4. قم بإعداد وسط EC بإضافة 1: 100 (v / v) البنسلين / الستربتومايسين (10000 وحدة / مل). املأ الغرفة العلوية لكل تجويف ب 250 ميكرولتر من وسط EC والغرفة السفلية ب 150 ميكرولتر من وسط EC.
  5. حصاد HUVEC من دورق T25 متقارب: يغسل ب 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco بدون المغنيسيوم والكالسيوم PBS (-/-) ، أضف 1 مل من 0.25٪ Trypsin + 1 mM EDTA في PBS (-/-) واحتضانه لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية. أوقف نشاط التربسين بإضافة 5 مل من PBS (+/+) + 5٪ FCS وأجهزة طرد مركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط EC.
  6. استخدم تخفيفا تسلسليا بنسبة 1:10 عند إجراء عد الخلايا. أضف 10 ميكرولتر من حبيبات الخلايا المعاد تعليقها إلى 90 ميكرولتر من وسط الخلية. الجمع بين العينات بعناية. استخدم أنبوب طرد مركزي دقيق مع 10 ميكرولتر من صبغة تريبان الزرقاء. قم بتخفيف محلول الخلية باستخدام التريبان الأزرق (1: 1) باستخدام شرائح غرفة عد الخلايا. عد الخلايا إما يدويا باستخدام غرفة نيوباور أو باستخدام عداد خلايا آلي. تحديد عدد الخلايا وضبط التركيز إلى 0.4 × 106 خلايا لكل 200 ميكرولتر.
  7. استبدل وسط الخلية البطانية في الغرفة العلوية للرقاقة الحيوية ب 200 ميكرولتر من وسط EC الذي يحتوي على HUVECs المعلقة. ماصة بلطف لتجنب تشكيل فقاعات الهواء في القنوات أو الغرف. ضع طبق بتري الزجاجي مع الرقائق الحيوية على حرارة 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.

2. اليوم الثاني: فحص طبقة الخلية

  1. في اليوم 2 ، تحقق بصريا من التقاء طبقة خلية HUVEC في الغرفة العلوية. قم بإجراء تبادل متوسط في الغرفة العلوية باستخدام 300 ميكرولتر من وسط EC. ماصة بلطف لتجنب انفصال الخلايا عن الغشاء. إجراء تبادل وسائل الإعلام يوميا بعد 24h. ضع طبق بتري الزجاجي مع الرقائق الحيوية مرة أخرى على حرارة 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.

3. اليوم الثالث: إعداد الغرفة السفلى

  1. تحقق بصريا من التقاء طبقة الخلايا البطانية. عند هذه النقطة ، حدد وجود طبقة متقاربة ومورفولوجيا تشبه الحصى (الشكل 1). قم بإجراء تبادل متوسط في الغرفة العلوية باستخدام 300 ميكرولتر من وسط EC.
  2. بعد ذلك ، قم بإعداد الغرفة السفلية لبذر الخلايا التي تشكل الطبقة الظهارية. اغسل الحجرة السفلية برفق باستخدام 150 ميكرولتر من وسط RPMI (أضف 1: 100 (v / v) البنسلين / الستربتومايسين (10000 وحدة / مل) ، مصل بقرة الجنين 5٪ ، 1 ميكرومتر ديكساميثازون).
  3. بالنسبة للغرفة السفلية ، يتم تعليق خلايا البذور 0.5 × 106 H441 في 200 ميكرولتر من وسط RPMI (RPMI) لكل تجويف.
  4. حصاد خلايا H441
    1. اغسل الخلايا ب 5 مل من PBS (-/-) مرة واحدة. أضف 2 مل من 0.25٪ تربسين + 1 مللي مول EDTA في برنامج تلفزيوني (-/-).
    2. احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. يختلف وقت الحضانة اعتمادا على التقاء الطبقة. في غضون 5-7 دقائق ، يجب أن تنفصل الخلايا تماما.
    3. أوقف نشاط التربسين باستخدام 10 مل من PBS (+/+) + 5٪ FBS ، واجمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 4 دقائق.
    4. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من RPMI ، وعدها.
    5. بذرة 0.5 × 106 خلايا لكل غرفة عن طريق سحب محلول الخلية برفق في الغرفة السفلية. أغلق جميع المنافذ واقلب الرقاقة الحيوية رأسا على عقب حتى تتمكن الخلايا من الالتصاق بغشاء PET. حافظ على الرقاقة الحيوية رأسا على عقب واحتضانها طوال الليل في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.

4. الأيام 4 - اليوم 7: صيانة الخلايا وحصاد الخلايا الوحيدة

  1. أداء التبادل المتوسط اليومي في الغرفة العلوية والسفلية. بالنسبة للغرفة العلوية ، قم بإجراء التبادل المتوسط باستخدام 300 ميكرولتر من وسط EC.
  2. استخدم 200 ميكرولتر من RPMI + (متوسط RPMI بالإضافة إلى 1: 100 (v / v) البنسلين / الستربتومايسين (10000 وحدة / مل) ، 10 نانوغرام / مل GM-CSF ، مصل بشري ذاتي المنشأ 10٪ ، 1 ميكرومتر ديكساميثازون) للغرفة السفلية. في اليوم 7 ، اغسل الغرفة السفلية باستخدام RPMI + لإعداد التجويف لبذر الخلايا الوحيدة.
  3. البذور 0.1 × 106 حيدات معلقة في 200 ميكرولتر RPMI + في الغرفة السفلية.
  4. حصاد وحيدات
    1. اغسل الخلايا ب 1 مل من PBS (-/-) واحتضانها لمدة 7 دقائق عند 37 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني مسخن مسبقا (-/-) يحتوي على 4 مجم / مل ليدوكائين + 5 مللي مول EDTA عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    2. اجمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 7 دقائق ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من RPMI + ، وقم بالعد. ضع منافذ الرقاقة الحيوية متجهة لأسفل بحيث تلتصق الخلايا بالغشاء.

5. اليوم 8: تروية الرقاقة الحيوية

  1. في هذه المرحلة ، تأكد من أن الرقائق الحيوية جاهزة للتوصيل بالتدفق والتعطير. قبل البدء في التروية ، قم بإعداد حاضنة فارغة ووضع المضخة التمعجية في الداخل.
  2. نضح الرقائق الحيوية
    1. قبل توصيل الأنبوب المعقم بالرقاقة الحيوية ، اغسل الأنبوب ب 200 ميكرولتر من PBS (+/+) ، متبوعا ب 200 ميكرولتر من وسط EC. يبلغ قطر الأنبوب الداخلي 0.5 مم ، ويتكون من جوانب أطول (20 سم) وأقصر (12 سم) مقسومة على سدادتين للمضخة التمعجية. ضع الأنبوب جانبا وقم بإعداد الخزانات للوسط.
    2. قم بإجراء تبادل متوسط في الغرف العلوية والسفلية عن طريق غسلها بوسط زراعة الخلايا المحضر حديثا.
    3. أدخل الخزان على جانب مخرج الرقاقة الحيوية وقم بتوصيل الخزان بالأنبوب بمدخل الرقاقة الحيوية (الشكل 2). قم بتوصيل الأنبوب بالخزان والرقاقة الحيوية بحيث يكون هناك نضح متوسط دائري بين الخزان والرقاقة الحيوية.
    4. بمجرد توصيل كل شيء بالمنافذ ، املأ الخزان ب 500 ميكرولتر من وسيط EC. قم بتوصيل الرقاقة الحيوية بالأنبوب الموجود على التروية بمعدل تدفق 21 ميكرولتر / دقيقة (الشكل 2). راقب عن كثب خلال أول 15 دقيقة من التروية لإدخال الفقاعات. أداء التبادل المتوسط يوميا في كلا المجلسين.

6. اليوم 9 - اليوم 11: إنشاء واجهة هواء سائل

  1. أوقف التروية ، وأفرغ الخزانات ، وأعد تعبئتها بوسط طازج تحت خزانة أمان معقمة. ماصة 500 ميكرولتر من وسط EC في الخزانات واغسل الغرفة السفلية برفق ب 200 ميكرولتر من RPMI +. ابدأ التروية مرة أخرى بمعدل تروية يبلغ 21 ميكرولتر / دقيقة.
  2. واجهة سائل الهواء (ALI)
    1. قم بإنشاء ALI من اليوم 12 حتى نهاية التجربة (اليوم 14). أثناء زراعة ALI ، قم بتعريض الخلايا الظهارية للهواء.
    2. لإنشاء ثقافة ALI ، قم بإعداد وسط وعائي جديد EC (أضف 1: 100 (v / v) البنسلين / الستربتومايسين (10000 وحدة / مل) ، 10 نانوغرام / مل GM-CSF ، 20٪ مصل بشري ذاتي المنشأ ، 1μM ديكساميثازون) للحفاظ على جميع أنواع الخلايا في الشريحة. في هذه المرحلة ، يحتوي الوسط على تركيز أعلى من AS (20٪).
    3. افتح المقابس الموجودة في الحجرة السفلية أسفل خزانة أمان معقمة وامتص الوسط بعناية حتى تظهر فقاعة هواء ، كما هو موضح في الشكل 3. تأكد من إزالة السائل بالكامل من القناة والغرفة وأغلق المنافذ بعناية.
    4. املأ الخزانات بوسط EC (-/-) واستمر في زراعة التروية بمعدل تدفق 21 ميكرولتر / دقيقة. تبادل الوسط فقط في الغرفة العلوية حتى اليوم 14 والحفاظ على الخلايا الظهارية في الغرفة السفلية بالهواء فقط.

7. اليوم 14: حصاد الأنسجة وتحليلها

  1. افصل الرقاقة الحيوية عن التدفق. قم بتوصيل الأنبوب وتحقق من المجهر بحثا عن التقاء الخلايا. بسبب الهواء في الغرفة السفلية ، قد تبدو طبقات الخلايا غامضة ويصعب تصورها. في هذه المرحلة ، يكون النموذج جاهزا لمزيد من التجارب.
  2. تثبيت وتلطيخ الأنسجة في الرقاقة الحيوية
    1. اغسل التجاويف باستخدام PBS (+/+) لإزالة وسط زراعة الخلايا. ماصة 300 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) يذوب في PBS (-/-) إلى الغرفة العلوية و 200 ميكرولتر في الغرفة السفلية ويحتضن لمدة 10 دقائق في RT.
      ملاحظة: عند العمل مع المواد الكيميائية المثبتة مثل PFA، استخدم غطاء الدخان. جمع النفايات والتخلص منها وفقا لذلك.
    2. اغسل الغرف 3x باستخدام PBS (+/+). بعد التثبيت ، قم بتخزين الرقائق الحيوية في درجة حرارة 4 درجات مئوية أو استخدمها مباشرة لتلطيخ الخلايا المناعية.
    3. للنفاذية ، ماصة 300 ميكرولتر من 0.25٪ Triton X-100 في PBS (+/+). احتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
    4. بعد الحضانة ، اغسل كلتا الغرفتين باستخدام PBS (+/+) وماصة 300 ميكرولتر من 3٪ ألبومين مصل البقر (BSA) في PBS (+/+) في كلا الغرفتين. احتضان لمدة 1 ساعة في RT.
    5. في غضون ذلك ، قم بإعداد لوحة الأجسام المضادة لتلطيخ التألق المناعي. لإعداد لوحة الأجسام المضادة لتلطيخ التألق المناعي ، تم إعداد أنبوب يحتوي على كمية كافية من 3٪ BSA لتخفيف الأجسام المضادة. استخدم 50 ميكرولتر من تخفيفات الأجسام المضادة لكل غشاء. استخدم نسبة تخفيف تبلغ 1: 100 لألواح الأجسام المضادة الأولية و 1: 200 لألواح الأجسام المضادة الثانوية. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة للوحة الأجسام المضادة الثانوية ، قم بإعداد DAPI بنسبة تخفيف 1: 2,000. للاطلاع على الأجسام المضادة المقابلة، انظر (الجدول 1).
    6. للوصول مباشرة إلى الخلايا داخل الرقاقة الحيوية ، يجب إزالة رقائق الترابط. لفتح غرف الموائع الدقيقة ، قم بإجراء قطع دقيق عبر الجزء الخارجي من التجويف وإزالة رقائق الترابط. اقطع الغشاء عن طريق إزالة الحواف المختومة على الرقاقة الحيوية بالمشرط.
      ملاحظة: اعمل بدقة ودقة خلال هذه الخطوة لتجنب أي تلف في الغشاء وإصابات بسبب حدة المشرط.
    7. بعد فصل الغشاء عن الرقاقة الحيوية ، قسم الغشاء إلى قطعتين. جمع قطع الغشاء مع ملقط ووضعها على شريحة مجهرية لتلطيخ.
    8. ماصة 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة لكل قطعة غشاء. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية ، محمية من الضوء.
    9. بعد الحضانة ، ضع الغشاء في 500 ميكرولتر من PBS (-/-) في 24 صفيحة بئر واغسل الغشاء 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما في PBS (+/+). بعد الغسيل ، ماصة 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي واحتضان لمدة 1 ساعة في RT محمية من الضوء.
    10. اغسل الغشاء باستخدام برنامج تلفزيوني (+/+) 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما. في هذه الأثناء ، قم بإعداد وتسمية الشرائح المجهرية للتجربة. ضع قطرة من وسيط التثبيت على الشريحة وضع الغشاء المقابل. كرر هذه الخطوة لجميع الأغشية. في النهاية ، ضع قطرة أخرى من وسيط التثبيت في الجزء العلوي من الغشاء واستخدم غطاء زجاجي. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.

النتائج

يمكن إجراء فحص للتغيرات المورفولوجية والتعبير عن بروتينات العلامة باستخدام تلطيخ التألق المناعي. بعد الزراعة المشتركة لمدة 14 يوما ، يتم تحليل الجوانب الوعائية والظهارية للتعبير عن علامات الخلايا المعنية. هذه الطريقة مفيدة لدراسة تفاعلات وسلامة المكونات الوعائية والظهارية ، وهو أمر ضرو...

Discussion

يمثل نموذج الحويصلات الهوائية على الرقاقة نموذجا نسيجيا متعدد الطبقات للحويصلات الهوائية البشرية ، يدمج أنواع الخلايا الأساسية في الجهاز التنفسي السفلي ، بما في ذلك الخلايا الظهارية الرئوية والخلايا البطانية والبلاعم ، المزروعة بترتيب عضوي في ALI مع نضح متوسط للبطانة البطانية. تعبر خلاي...

Disclosures

KR هو الرئيس التنفيذي لشركة Dynamic42 GmbH ويمتلك أسهما في الشركة. A.S.M. هو مستشار علمي لشركة Dynamic 42 GmbH ويمتلك أسهما في الشركة. جميع المؤلفين الآخرين ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يقر H.K. و A.S.M. بالتمويل المقدم من Leibniz Science-Campus InfectoOptics Jena ، بتمويل من خط التمويل الشبكات الاستراتيجية لجمعية Leibniz. تم دعم MA و A.S.M. من قبل مشروع IMPROVE لمنتدى إدارة الإنترنت بتمويل من الوزارة الاتحادية للشؤون الاقتصادية والطاقة على أساس قرار من البوندستاغ الألماني. كما تقر A.S.M بالدعم المالي المقدم من مجموعة توازن التميز في Microverse في إطار استراتيجية التميز الألمانية - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Consumables
Cellcounting chamber slides (Countess)InvitrogenC10283
Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, sterilGreiner Bio-One662 160
Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, sterilGreiner Bio-One657 160
Coverslips (24x40mm; #1.5)Menzel-Gläser15747592
Eco wipesDr. Schuhmacher00-915-REW10003-01
Eppies 2.0Sarstedt72.691
Eppis 0.5Sarstedt72.699
Eppis 1.5Sarstedt72.690.001
Falcons 15mLGreiner Bio-One188 271-TRI
Falcons 50mLGreiner Bio-One227 261-TRI
Gauze swabNobaPZN 2417767
Gloves Nitril 3000Meditrade1280
Microscope slidesMenzel-GläserAAAA000001##12E
Multiwell Plates 24 Well, sterileGreiner Bio-One662 160
Pasteur pipettes (glass) 150mmAssistent40567001
Pasteur pipettes (glass) 230mmAssistent40567002
Round-bottom tubes (PS, 5mL)Falcon352052
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mmSarstedt85.1637.235
ScalpelsDahlhausen11.000.00.715
Serological pipettes 10mLGreiner Bio-One607 160-TRI
Serological pipettes 25mLGreiner Bio-One760 160-TRI
Serological pipettes 2mLGreiner Bio-One710 160-TRI
Serological pipettes 50mLGreiner Bio-One768 160-TRI
Serological pipettes 5mLGreiner Bio-One606 160-TRI
S-Monovette, 7,5ml Z-GelSarstedt1.1602
S-Monovette, 9,0ml K3ESarstedt02.1066.001
Softasept NBraun3887138
T25 flaskGreiner Bio-One690 960
Tips sterile 10µLGreiner Bio-One771 261
Tips sterile 1250µLGreiner Bio-One750 261
Tips sterile 300µLGreiner Bio-One738 261
Tips unsterile 10µLGreiner Bio-One765 290
Tips unsterile 1000µLGreiner Bio-One739 291
Tips unsterile 200µLGreiner Bio-One686 290
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)RothK343.1
Chemicals
Descosept AFDr. SchuhmacherN-20338
Ethanol 96%Nordbrand-Nordhausen410
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa)Sigma AldrichFD4-100MG
Fluorescent Mounting MediumDakoS3023
MethanolVWR20847.295
SaponinFluka47036
TergazymeAlconox1304-1
Cell culture
Collagen IVSigma-AldrichC5533-5MG
DexametasonSigma-AldrichD4902
DPBS (-/-)LonzaBE17-516F
DPBS (+/+)LonzaBE17-513F
EDTA solutionSigma-AldrichE788S
Endothelial Cell Growth MediumPromocellC-22020
Endothelial Cell Growth Medium supplement mixPromocellC-39225
Fetal bovine SerumSigma-AldrichE2129-10g
H441ATCC
Human recombinant GM-CSFPeprotech300-30
LidocainSigma-AldrichL5647-15G
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140-122 /-163
RPMIGibco72400047
Trypane blue stain 0.4%InvitrogenT10282
TrypsinGibco15090-046
Primary antibodies
Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat)BD610252
CD68 (rabbit)CellSignaling76437
E-Cadherin (goat)R&DAF748
SP-A (mouse)Abcamab51891
Secondary antibodies
AF488 (donkey anti mouse)InvitrogenR37114
AF647 (donkey anti mouse)invitrogenA31571
AF647 (donkey anti rabbit)InvitrogenA31573
Cy3 (donkey anti goat)jackson research705-165-147
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)InvitrogenD3571
Microfluidic
ChipDynamic 42BC002
Male Luer Lock (small)ChipShop09-0503-0270-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, greenMicrofluidic chipshop09-0558-0336-11
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaqueMicrofluidic chipshop09-0556-0336-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, redMicrofluidic chipshop09-0557-0336-10
PlugsCole ParmerGZ-45555-56
Reservoir 4.5mLChipShop16-0613-0233-09
TubingDynamic 42ST001
Equipment
AutoclaveTuttnauer5075 ELV
CentrifugeEppendorf5424
CO2 IncubatorHeracell150i
Countess automated cell counterInvitrogenC10227
FlowcytometerBDFACS Canto II
Freezer (-20 °C)LiebherrLCexv 4010
Freezer (-80 °C)HeraeusHerafreeze HFU 686
FridgeLiebherrLCexv 4010
Heraeus MultifugeThermo ScientificX3R
MicroscopeLeicaDM IL LED
Orbital shakerHeidolphReax2000
Peristaltic pumpREGLO Digital MS-4/12ISM597D
Pipettes 10µLEppendorf Research plus3123000020
Pipettes 100µLEppendorf Research plus3123000047
Pipettes 1000µLEppendorf Research plus3123000063
Pipettes 2.5µLEppendorf Research plus3123000012
Pipettes 20µLEppendorf Research plus3123000039
Pipettes 200µLEppendorf Research plus3123000055
ScaleSartorius6101
ScaleSartoriusTE1245
Sterile benchKojairBiowizard SL-130
WaterbathJulaboSW-20C
Fluorescence Microscope Setup
Apotome.2Zeiss
Illumination deviceZeissHXP 120 C
MicroscopeZeissAxio Observer 5
Optical SectioningZeissApoTome
Power Supply MicroscopeZeissEplax Vp232
Software
ZEN Blue EditionZeiss

References

  1. Mettelman, R. C., Allen, E. K., Thomas, P. G. Mucosal immune responses to infection and vaccination in the respiratory tract. Immunity. 55 (5), 749-780 (2022).
  2. Artzy-Schnirman, A., et al. Advanced in vitro lung-on-chip platforms for inhalation assays: From prospect to pipeline. Eur J Pharma Biopharma. 144, 11-17 (2019).
  3. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  4. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nat Meth. 13 (2), 151-157 (2016).
  5. Ronaldson-Bouchard, K., et al. A multi-organ chip with matured tissue niches linked by vascular flow. Nat Biomed Eng. 6 (4), 351 (2022).
  6. Deinhardt-Emmer, S., et al. Co-infection with staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model. Biofabrication. 12 (2), 025012 (2020).
  7. Schicke, E., et al. Staphylococcus aureus lung infection results in down-regulation of surfactant protein-a mainly caused by pro-inflammatory macrophages. Microorganisms. 8 (4), 577 (2020).
  8. King, S. D., Chen, S. Y. Recent progress on surfactant protein a: Cellular function in lung and kidney disease development. Am J Physiol Cell Physiol. 319 (2), C316-C320 (2020).
  9. Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420 (2022).
  10. Yuksel, H., Ocalan, M., Yilmaz, O. E-cadherin: An important functional molecule at respiratory barrier between defence and dysfunction. Front Physiol. 12, 720227 (2021).
  11. Van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule e-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

H441 HUVECs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved