نموذج الحويصلات الهوائية على الرقاقة المناعي لدراسة الاستجابات المناعية المخاطية السنخية

Summary

نماذج الرئة على رقاقة تتجاوز الثقافات التقليدية 2D من خلال محاكاة واجهة الهواء السائل ونضح الخلايا البطانية، ومحاكاة تدفق الدم وتبادل المغذيات حاسمة لدراسات فسيولوجيا الرئة. هذا يعزز أهمية أبحاث الرئة ، ويوفر بيئة ديناميكية ودقيقة من الناحية الفسيولوجية لتعزيز فهم وعلاج التهابات الجهاز التنفسي.

Abstract

نقدم نموذجا متقدما للرئة على الرقاقة ذات الكفاءة المناعية مصمما لتكرار البنية السنخية البشرية ووظيفتها. يستخدم هذا النموذج المبتكر رقاقة حيوية ذات موائع دقيقة تدعم واجهة الهواء والسائل التي تحاكي البيئة في الحويصلات الهوائية البشرية. تستخدم هندسة الأنسجة لدمج المكونات الخلوية الرئيسية ، بما في ذلك الخلايا البطانية والبلاعم والخلايا الظهارية ، لإنشاء نموذج نسيجي تمثيلي للحويصلات الهوائية. يسهل النموذج إجراء فحوصات متعمقة للاستجابات المناعية المخاطية لمسببات الأمراض المختلفة ، بما في ذلك الفيروسات والبكتيريا والفطريات ، وبالتالي تعزيز فهمنا لمناعة الرئة. الهدف الأساسي من هذا البروتوكول هو توفير تفاصيل لإنشاء نموذج الحويصلات الهوائية على الرقاقة كمنصة قوية في المختبر لدراسات العدوى ، مما يمكن الباحثين من مراقبة وتحليل التفاعلات المعقدة بين مسببات الأمراض والجهاز المناعي للمضيف داخل البيئة الرئوية عن كثب. يتم تحقيق ذلك من خلال تطبيق التقنيات القائمة على الموائع الدقيقة لمحاكاة الظروف الفسيولوجية الرئيسية للحويصلات الهوائية البشرية ، بما في ذلك تدفق الدم والتحفيز الميكانيكي الحيوي للخلايا البطانية ، إلى جانب الحفاظ على واجهة الهواء والسائل الضرورية للتعرض الواقعي للخلايا الظهارية للهواء. يتوافق النظام النموذجي مع مجموعة من المقايسات الموحدة ، مثل تلطيخ التألق المناعي ، وتوصيف السيتوكين ، وتحليل وحدة تكوين المستعمرات (CFU) / اللويحات ، مما يسمح برؤى شاملة لديناميكيات المناعة أثناء العدوى. تتكون الحويصلات الهوائية على الرقاقة من أنواع الخلايا الأساسية ، بما في ذلك الخلايا الظهارية الرئوية البشرية البعيدة (H441) والخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs) مفصولة بأغشية البولي إيثيلين تيريفثاليت المسامية (PET) ، مع وجود بلاعم أولية مشتقة من الخلايا الوحيدة في وضع استراتيجي بين الطبقات الظهارية والبطانية. يعزز نموذج الأنسجة القدرة على تشريح وتحليل العوامل الدقيقة التي تنطوي عليها الاستجابات المناعية الرئوية في المختبر. كأداة قيمة ، يجب أن تساهم في تقدم أبحاث الرئة ، وتوفير نموذج أكثر دقة وديناميكية في المختبر لدراسة التسبب في التهابات الجهاز التنفسي واختبار التدخلات العلاجية المحتملة.

Introduction

تلعب الرئة البشرية دورا ملحوظا في التنفس والدفاع المناعي ، مع تفاعلات معقدة بين الاستجابات المناعية للغشاء المخاطي السنخي¹. تعد قدرة الحويصلات الهوائية على خلق استجابة مناعية فعالة أمرا حيويا للوقاية من التهابات الرئة وتأمين الصحة الرئوية. نظرا لأن الرئتين تتعرض باستمرار لمجموعة واسعة من المخاطر المحتملة ، بما في ذلك البكتيريا والفيروسات والفطريات والحساسية والجسيمات ، فإن فهم تعقيدات الاستجابات المناعية المخاطية السنخية أمر بالغ الأهمية لاكتشاف الآليات الكامنة وراء التهابات الجهاز التنفسي والاضطرابات الالتهابية وعلاج الأمراض الرئوية¹.

لدراسة العدوى والعمليات المرتبطة بالالتهاب في الجهاز التنف....

Protocol

يتم عزل خلايا HUVEC من الحبال السرية وتستخدم حتى الممر 4. يتم عزل الخلايا الوحيدة الأولية من المتبرعين الأصحاء من الدم الكامل. تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى جامعة يينا ، يينا ، ألمانيا (3939-12 / 13). وفقا لإعلان هلسنكي ، أعطى جميع الأفراد الذين يتبرعون بالخلايا للدراسة موافقتهم المستنيرة.

1. اليوم الأول: تحضير الرقاقة الحيوية

1. الرقائق الحيوية متوفرة بأحجام ونماذج مختلفة. للتجارب هنا ، استخدم النموذج BC002. ضع الرقاقة الحيوية في طبق بتري زجاجي ، واملأ الطبق ، واغسل جميع التجاويف بالإيثانول المعقم بنسبة 70٪ (EthOH). احتضان لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بمسح التجاويف 2x ....

النتائج

يمكن إجراء فحص للتغيرات المورفولوجية والتعبير عن بروتينات العلامة باستخدام تلطيخ التألق المناعي. بعد الزراعة المشتركة لمدة 14 يوما ، يتم تحليل الجوانب الوعائية والظهارية للتعبير عن علامات الخلايا المعنية. هذه الطريقة مفيدة لدراسة تفاعلات وسلامة المكونات الوعائية والظهارية ، وهو أمر ضرو.......

Discussion

يمثل نموذج الحويصلات الهوائية على الرقاقة نموذجا نسيجيا متعدد الطبقات للحويصلات الهوائية البشرية ، يدمج أنواع الخلايا الأساسية في الجهاز التنفسي السفلي ، بما في ذلك الخلايا الظهارية الرئوية والخلايا البطانية والبلاعم ، المزروعة بترتيب عضوي في ALI مع نضح متوسط للبطانة البطانية. تعبر خلاي.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Cellcounting chamber slides (Countess)	Invitrogen	C10283
Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril	Greiner Bio-One	662 160
Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril	Greiner Bio-One	657 160
Coverslips (24x40mm; #1.5)	Menzel-Gläser	15747592
Eco wipes	Dr. Schuhmacher	00-915-REW10003-01
Eppies 2.0	Sarstedt	72.691
Eppis 0.5	Sarstedt	72.699
Eppis 1.5	Sarstedt	72.690.001
Falcons 15mL	Greiner Bio-One	188 271-TRI
Falcons 50mL	Greiner Bio-One	227 261-TRI
Gauze swab	Noba	PZN 2417767
Gloves Nitril 3000	Meditrade	1280
Microscope slides	Menzel-Gläser	AAAA000001##12E
Multiwell Plates 24 Well, sterile	Greiner Bio-One	662 160
Pasteur pipettes (glass) 150mm	Assistent	40567001
Pasteur pipettes (glass) 230mm	Assistent	40567002
Round-bottom tubes (PS, 5mL)	Falcon	352052
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm	Sarstedt	85.1637.235
Scalpels	Dahlhausen	11.000.00.715
Serological pipettes 10mL	Greiner Bio-One	607 160-TRI
Serological pipettes 25mL	Greiner Bio-One	760 160-TRI
Serological pipettes 2mL	Greiner Bio-One	710 160-TRI
Serological pipettes 50mL	Greiner Bio-One	768 160-TRI
Serological pipettes 5mL	Greiner Bio-One	606 160-TRI
S-Monovette, 7,5ml Z-Gel	Sarstedt	1.1602
S-Monovette, 9,0ml K3E	Sarstedt	02.1066.001
Softasept N	Braun	3887138
T25 flask	Greiner Bio-One	690 960
Tips sterile 10µL	Greiner Bio-One	771 261
Tips sterile 1250µL	Greiner Bio-One	750 261
Tips sterile 300µL	Greiner Bio-One	738 261
Tips unsterile 10µL	Greiner Bio-One	765 290
Tips unsterile 1000µL	Greiner Bio-One	739 291
Tips unsterile 200µL	Greiner Bio-One	686 290
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)	Roth	K343.1
Chemicals
Descosept AF	Dr. Schuhmacher	N-20338
Ethanol 96%	Nordbrand-Nordhausen	410
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa)	Sigma Aldrich	FD4-100MG
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023
Methanol	VWR	20847.295
Saponin	Fluka	47036
Tergazyme	Alconox	1304-1
Cell culture
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG
Dexametason	Sigma-Aldrich	D4902
DPBS (-/-)	Lonza	BE17-516F
DPBS (+/+)	Lonza	BE17-513F
EDTA solution	Sigma-Aldrich	E788S
Endothelial Cell Growth Medium	Promocell	C-22020
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix	Promocell	C-39225
Fetal bovine Serum	Sigma-Aldrich	E2129-10g
H441	ATCC
Human recombinant GM-CSF	Peprotech	300-30
Lidocain	Sigma-Aldrich	L5647-15G
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122 /-163
RPMI	Gibco	72400047
Trypane blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282
Trypsin	Gibco	15090-046
Primary antibodies
Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat)	BD	610252
CD68 (rabbit)	CellSignaling	76437
E-Cadherin (goat)	R&D	AF748
SP-A (mouse)	Abcam	ab51891
Secondary antibodies
AF488 (donkey anti mouse)	Invitrogen	R37114
AF647 (donkey anti mouse)	invitrogen	A31571
AF647 (donkey anti rabbit)	Invitrogen	A31573
Cy3 (donkey anti goat)	jackson research	705-165-147
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
Microfluidic
Chip	Dynamic 42	BC002
Male Luer Lock (small)	ChipShop	09-0503-0270-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, green	Microfluidic chipshop	09-0558-0336-11
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque	Microfluidic chipshop	09-0556-0336-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, red	Microfluidic chipshop	09-0557-0336-10
Plugs	Cole Parmer	GZ-45555-56
Reservoir 4.5mL	ChipShop	16-0613-0233-09
Tubing	Dynamic 42	ST001
Equipment
Autoclave	Tuttnauer	5075 ELV
Centrifuge	Eppendorf	5424
CO2 Incubator	Heracell	150i
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227
Flowcytometer	BD	FACS Canto II
Freezer (-20 °C)	Liebherr	LCexv 4010
Freezer (-80 °C)	Heraeus	Herafreeze HFU 686
Fridge	Liebherr	LCexv 4010
Heraeus Multifuge	Thermo Scientific	X3R
Microscope	Leica	DM IL LED
Orbital shaker	Heidolph	Reax2000
Peristaltic pump	REGLO Digital MS-4/12	ISM597D
Pipettes 10µL	Eppendorf Research plus	3123000020
Pipettes 100µL	Eppendorf Research plus	3123000047
Pipettes 1000µL	Eppendorf Research plus	3123000063
Pipettes 2.5µL	Eppendorf Research plus	3123000012
Pipettes 20µL	Eppendorf Research plus	3123000039
Pipettes 200µL	Eppendorf Research plus	3123000055
Scale	Sartorius	6101
Scale	Sartorius	TE1245
Sterile bench	Kojair	Biowizard SL-130
Waterbath	Julabo	SW-20C
Fluorescence Microscope Setup
Apotome.2	Zeiss
Illumination device	Zeiss	HXP 120 C
Microscope	Zeiss	Axio Observer 5
Optical Sectioning	Zeiss	ApoTome
Power Supply Microscope	Zeiss	Eplax Vp232
Software
ZEN Blue Edition	Zeiss