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要約

Lung-on-Chipモデルは、空気と液体の界面と内皮細胞の灌流を模倣することで、従来の2D培養を凌駕し、肺生理学研究に不可欠な血流と栄養交換をシミュレートします。これにより、肺研究の関連性が高まり、呼吸器感染症の理解と治療を進めるためのダイナミックで生理学的に正確な環境が提供されます。

要約

私たちは、ヒト肺胞の構造と機能を再現するように設計された高度な免疫適格肺オンチップモデルを紹介します。この革新的なモデルは、ヒト肺胞の環境を模倣した気液界面をサポートするマイクロ流体灌流バイオチップを採用しています。組織工学は、内皮細胞、マクロファージ、上皮細胞などの主要な細胞成分を統合して、肺胞の代表的な組織モデルを作成するために使用されます。このモデルは、ウイルス、細菌、真菌などのさまざまな病原体に対する粘膜免疫応答の詳細な調査を容易にし、肺免疫の理解を深めます。このプロトコルの主な目標は、この肺胞オンチップモデルを感染研究のための堅牢な in vitro プラットフォームとして確立するための詳細を提供し、研究者が肺環境内の病原体と宿主の免疫系との間の複雑な相互作用を綿密に観察および分析できるようにすることです。これは、マイクロ流体ベースの技術を適用して、血流や内皮細胞の生体力学的刺激など、ヒト肺胞の主要な生理学的状態をシミュレートするとともに、上皮細胞の空気への現実的な曝露に不可欠な気液界面を維持することによって達成されます。このモデルシステムは、免疫蛍光染色、サイトカインプロファイリング、コロニー形成単位(CFU)/プラーク分析など、さまざまな標準化されたアッセイと互換性があり、感染中の免疫動態に関する包括的な洞察を可能にします。Alveolus-on-chipは、多孔質ポリエチレンテレフタレート(PET)膜で分離されたヒト遠位肺上皮細胞(H441)やヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)などの必須細胞タイプで構成され、初代単球由来マクロファージが上皮層と内皮層の間に戦略的に配置されています。この組織モデルは、 in vitroで肺免疫応答に関与する微妙な因子を解剖し、解析する能力を高めます。貴重なツールとして、呼吸器感染症の病因を研究し、潜在的な治療介入をテストするためのより正確で動的な in vitro モデルを提供し、肺研究の進歩に貢献するはずです。

概要

ヒトの肺は、呼吸と免疫防御において顕著な役割を果たしており、肺胞粘膜の免疫応答と免疫応答の間には複雑な相互作用があります1。肺胞が効率的な免疫応答を作り出す能力は、肺感染症を予防し、肺の健康を確保するために不可欠です。肺は常に細菌、ウイルス、真菌、アレルギー、粒子状物質など、さまざまな潜在的なリスクにさらされているため、肺胞粘膜免疫応答の複雑さを理解することは、呼吸器感染症、炎症性疾患の背後にあるメカニズムを発見し、肺疾患の治療に不可欠です1。

気道の感染および炎症関連プロセスをin vitroで研究するには、肺胞の環境と免疫応答を忠実に模倣できるモデルが必要です。2D細胞培養および動物モジュールは、肺免疫応答に関する生物医学研究に不可欠なツールとして何十年にもわたって使用されてきました。しかし、人間の状況への翻訳の可能性には限界があることが多いのです。Lung-on-chipモデルは、従来のin vitroモデルとin vivoモデルの間のギャップを埋めることに貢献し、ヒト特異的な免疫応答を研究するための新しいアプローチを提供することができます2,3。Lung-on-Chipモデルは、肺細胞が気道の生理学的状態....

プロトコル

HUVEC細胞は臍帯から単離され、継代4まで使用されます。初代単球は、全血から健康なドナーから単離されます。この研究は、ドイツのイェーナにあるイェーナ大学病院の倫理委員会によって承認されました (3939-12/13)。ヘルシンキ宣言によると、この研究のために細胞を提供したすべての個人は、インフォームドコンセントを提供しました。

1. 1日目:バイオチップの準備

  1. バイオチップには、さまざまなサイズとモデルがあります。ここでの実験には、モデルBC002を使用します。バイオチップをガラスのシャーレに入れ、ディッシュに充填し、すべての空洞を滅菌70%エタノール(EthOH)で洗い流します。室温で45分間インキュベートします。その後、滅菌済みのddH2Oでキャビティを2倍洗い流し、ddH2Oを取り外します。
  2. 青色のチップ付き1,000 μLピペットを使用して、コラーゲンIV溶液を両方の空洞に穏やかに洗い流し、滅菌コラーゲンIV溶液(0.5 mg/mL 0.5 mM酢酸溶液中0.5 mg/mL、マグネシウムおよびカルシウムPBSを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水に1:100濃度を使用)で、両空洞のバイオチップメンブレンをコーティングします。37°Cおよび5%CO2で15分間インキュベートします。
    注:1,000 μLピペットとブルーフィルタ....

代表的な結果

形態学的変化およびマーカータンパク質の発現の検査は、免疫蛍光染色を用いて実施することができる。14日間共培養した後、血管側と上皮側をそれぞれの細胞マーカーの発現について分析します。この方法は、血管および上皮成分の相互作用と完全性の研究に有用であり、感染に関連する機能的な生物学的読み出しとして疾患モデリングに不可欠です。免疫蛍光染色は、定量分析、形態学?.......

ディスカッション

alveolus-on-chipモデルは、ヒト肺胞の多層組織モデルを表しており、肺上皮細胞、内皮細胞、マクロファージなどの下気道の必須細胞タイプを統合し、内皮内層の中程度の灌流を伴うALIで器官型配置で培養します。異なる層の細胞は、肺上皮細胞のカルシウム依存性接着分子であるE-カドヘリンなどの特定の細胞マーカータンパク質を発現し、これは細胞間上皮バリアの確立において中心的な役?.......

開示事項

K.R.はDynamic42 GmbHのCEOであり、同社の株式を保有しています。A.S.M.はDynamic 42 GmbHの科学顧問であり、同社の株式を保有しています。他のすべての著者には利益相反はありません。

謝辞

H.K.とA.S.M.は、ライプニッツ協会の戦略的ネットワーキングの資金提供を受けて、ライプニッツ・サイエンス・キャンパス・インフェクトオプティクス・イェーナからの資金提供を受けています。M.A.とA.S.M.は、ドイツ連邦議会の決議に基づき、連邦経済エネルギー省が資金提供するIGFプロジェクトIMPROVEの支援を受けました。A.S.Mはさらに、ドイツのエクセレンス戦略 - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860の下で、マイクロバースのクラスター・オブ・エクセレンス・バランスによる財政支援を認めています。

....

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Consumables
Cellcounting chamber slides (Countess)InvitrogenC10283
Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, sterilGreiner Bio-One662 160
Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, sterilGreiner Bio-One657 160
Coverslips (24x40mm; #1.5)Menzel-Gläser15747592
Eco wipesDr. Schuhmacher00-915-REW10003-01
Eppies 2.0Sarstedt72.691
Eppis 0.5Sarstedt72.699
Eppis 1.5Sarstedt72.690.001
Falcons 15mLGreiner Bio-One188 271-TRI
Falcons 50mLGreiner Bio-One227 261-TRI
Gauze swabNobaPZN 2417767
Gloves Nitril 3000Meditrade1280
Microscope slidesMenzel-GläserAAAA000001##12E
Multiwell Plates 24 Well, sterileGreiner Bio-One662 160
Pasteur pipettes (glass) 150mmAssistent40567001
Pasteur pipettes (glass) 230mmAssistent40567002
Round-bottom tubes (PS, 5mL)Falcon352052
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mmSarstedt85.1637.235
ScalpelsDahlhausen11.000.00.715
Serological pipettes 10mLGreiner Bio-One607 160-TRI
Serological pipettes 25mLGreiner Bio-One760 160-TRI
Serological pipettes 2mLGreiner Bio-One710 160-TRI
Serological pipettes 50mLGreiner Bio-One768 160-TRI
Serological pipettes 5mLGreiner Bio-One606 160-TRI
S-Monovette, 7,5ml Z-GelSarstedt1.1602
S-Monovette, 9,0ml K3ESarstedt02.1066.001
Softasept NBraun3887138
T25 flaskGreiner Bio-One690 960
Tips sterile 10µLGreiner Bio-One771 261
Tips sterile 1250µLGreiner Bio-One750 261
Tips sterile 300µLGreiner Bio-One738 261
Tips unsterile 10µLGreiner Bio-One765 290
Tips unsterile 1000µLGreiner Bio-One739 291
Tips unsterile 200µLGreiner Bio-One686 290
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)RothK343.1
Chemicals
Descosept AFDr. SchuhmacherN-20338
Ethanol 96%Nordbrand-Nordhausen410
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa)Sigma AldrichFD4-100MG
Fluorescent Mounting MediumDakoS3023
MethanolVWR20847.295
SaponinFluka47036
TergazymeAlconox1304-1
Cell culture
Collagen IVSigma-AldrichC5533-5MG
DexametasonSigma-AldrichD4902
DPBS (-/-)LonzaBE17-516F
DPBS (+/+)LonzaBE17-513F
EDTA solutionSigma-AldrichE788S
Endothelial Cell Growth MediumPromocellC-22020
Endothelial Cell Growth Medium supplement mixPromocellC-39225
Fetal bovine SerumSigma-AldrichE2129-10g
H441ATCC
Human recombinant GM-CSFPeprotech300-30
LidocainSigma-AldrichL5647-15G
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140-122 /-163
RPMIGibco72400047
Trypane blue stain 0.4%InvitrogenT10282
TrypsinGibco15090-046
Primary antibodies
Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat)BD610252
CD68 (rabbit)CellSignaling76437
E-Cadherin (goat)R&DAF748
SP-A (mouse)Abcamab51891
Secondary antibodies
AF488 (donkey anti mouse)InvitrogenR37114
AF647 (donkey anti mouse)invitrogenA31571
AF647 (donkey anti rabbit)InvitrogenA31573
Cy3 (donkey anti goat)jackson research705-165-147
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)InvitrogenD3571
Microfluidic
ChipDynamic 42BC002
Male Luer Lock (small)ChipShop09-0503-0270-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, greenMicrofluidic chipshop09-0558-0336-11
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaqueMicrofluidic chipshop09-0556-0336-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, redMicrofluidic chipshop09-0557-0336-10
PlugsCole ParmerGZ-45555-56
Reservoir 4.5mLChipShop16-0613-0233-09
TubingDynamic 42ST001
Equipment
AutoclaveTuttnauer5075 ELV
CentrifugeEppendorf5424
CO2 IncubatorHeracell150i
Countess automated cell counterInvitrogenC10227
FlowcytometerBDFACS Canto II
Freezer (-20 °C)LiebherrLCexv 4010
Freezer (-80 °C)HeraeusHerafreeze HFU 686
FridgeLiebherrLCexv 4010
Heraeus MultifugeThermo ScientificX3R
MicroscopeLeicaDM IL LED
Orbital shakerHeidolphReax2000
Peristaltic pumpREGLO Digital MS-4/12ISM597D
Pipettes 10µLEppendorf Research plus3123000020
Pipettes 100µLEppendorf Research plus3123000047
Pipettes 1000µLEppendorf Research plus3123000063
Pipettes 2.5µLEppendorf Research plus3123000012
Pipettes 20µLEppendorf Research plus3123000039
Pipettes 200µLEppendorf Research plus3123000055
ScaleSartorius6101
ScaleSartoriusTE1245
Sterile benchKojairBiowizard SL-130
WaterbathJulaboSW-20C
Fluorescence Microscope Setup
Apotome.2Zeiss
Illumination deviceZeissHXP 120 C
MicroscopeZeissAxio Observer 5
Optical SectioningZeissApoTome
Power Supply MicroscopeZeissEplax Vp232
Software
ZEN Blue EditionZeiss

参考文献

  1. Mettelman, R. C., Allen, E. K., Thomas, P. G. Mucosal immune responses to infection and vaccination in the respiratory tract. Immunity. 55 (5), 749-780 (2022).
  2. Artzy-Schnirman, A., et al.

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