Immunkompetentes Alveolen-on-Chip-Modell zur Untersuchung der Immunantworten der Alveolarschleimhaut

Zusammenfassung

Lung-on-Chip-Modelle übertreffen herkömmliche 2D-Kulturen, indem sie die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und die Perfusion der Endothelzellen nachahmen und den Blutfluss und den Nährstoffaustausch simulieren, die für lungenphysiologische Studien entscheidend sind. Dies erhöht die Relevanz der Lungenforschung und bietet eine dynamische, physiologisch genaue Umgebung, um das Verständnis und die Behandlung von Atemwegsinfektionen zu verbessern.

Zusammenfassung

Wir stellen ein fortschrittliches immunkompetentes Lung-on-Chip-Modell vor, das die Struktur und Funktion der menschlichen Alveolen replizieren soll. Dieses innovative Modell verwendet einen mikrofluidisch durchbluteten Biochip, der eine Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche unterstützt, die die Umgebung in den menschlichen Lungenbläschen nachahmt. Tissue Engineering wird verwendet, um wichtige zelluläre Komponenten wie Endothelzellen, Makrophagen und Epithelzellen zu integrieren, um ein repräsentatives Gewebemodell der Alveole zu erstellen. Das Modell ermöglicht es, die Immunantworten der Schleimhäute auf verschiedene Krankheitserreger, darunter Viren, Bakterien und Pilze, eingehend zu untersuchen und so unser Verständnis der Lungenimmunität zu verbessern. Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, Details für die Etablierung dieses Alveolen-on-Chip-Modells als robuste In-vitro-Plattform für Infektionsstudien bereitzustellen, die es den Forschern ermöglicht, die komplexen Wechselwirkungen zwischen Krankheitserregern und dem Immunsystem des Wirts in der pulmonalen Umgebung genau zu beobachten und zu analysieren. Dies wird durch die Anwendung mikrofluidischer Techniken erreicht, um wichtige physiologische Bedingungen der menschlichen Alveolen zu simulieren, einschließlich des Blutflusses und der biomechanischen Stimulation von Endothelzellen, sowie durch die Aufrechterhaltung einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche, die für die realistische Exposition von Epithelzellen gegenüber Luft entscheidend ist. Das Modellsystem ist mit einer Reihe von standardisierten Assays kompatibel, wie z. B. Immunfluoreszenzfärbung, Zytokinprofilierung und Koloniebildungseinheit (KBE)/Plaque-Analyse, was einen umfassenden Einblick in die Immundynamik während der Infektion ermöglicht. Der Alveolus-on-Chip besteht aus essentiellen Zelltypen, einschließlich humaner distaler Lungenepithelzellen (H441) und humaner Nabelvenendothelzellen (HUVECs), die durch poröse Polyethylenterephthalat-Membranen (PET) getrennt sind, wobei primäre Monozyten-abgeleitete Makrophagen strategisch zwischen der Epithel- und der Endothelschicht positioniert sind. Das Gewebemodell verbessert die Fähigkeit, die nuancierten Faktoren, die an der pulmonalen Immunantwort beteiligt sind, in vitro zu analysieren und zu analysieren. Als wertvolles Instrument soll es zur Weiterentwicklung der Lungenforschung beitragen, indem es ein genaueres und dynamischeres In-vitro-Modell für die Untersuchung der Pathogenese von Atemwegsinfektionen und die Erprobung potenzieller therapeutischer Interventionen bereitstellt.

Einleitung

Die menschliche Lunge spielt eine bemerkenswerte Rolle bei der Atmung und Immunabwehr, mit komplexen Wechselwirkungen zwischen den Immunantworten der Alveolarschleimhaut¹. Die Fähigkeit der Lungenbläschen, eine effiziente Immunantwort zu erzeugen, ist entscheidend für die Vorbeugung von Lungeninfektionen und die Sicherung der Lungengesundheit. Da die Lunge ständig einer Vielzahl potenzieller Risiken ausgesetzt ist, darunter Bakterien, Viren, Pilze, Allergien und Feinstaub, ist das Verständnis der Komplexität der Immunreaktionen der Alveolarschleimhaut entscheidend, um die Mechanismen hinter Atemwegsinfektionen, entzündlichen Erkrankungen und de....

Protokoll

HUVEC-Zellen werden aus Nabelschnüren isoliert und bis zur Passage 4 verwendet. Primäre Monozyten werden von gesunden Spendern aus Vollblut isoliert. Die Studie wurde von der Ethikkommission des Universitätsklinikums Jena, Jena, Deutschland genehmigt (3939-12/13). Laut der Erklärung von Helsinki gaben alle Personen, die Zellen für die Studie spendeten, ihre Einverständniserklärung.

1. Tag 1: Vorbereitung des Biochips

1. Die Biochips sind in verschiedenen Größen und Modellen erhältlich. Verwenden Sie für Experimente hier das Modell BC002. Legen Sie den Biochip in eine Petrischale aus Glas, füllen Sie die Schale und sp....

Diskussion

Das Alveolus-on-Chip-Modell stellt ein mehrschichtiges Gewebemodell der menschlichen Alveole dar, das essentielle Zelltypen der unteren Atemwege integriert, einschließlich Lungenepithelzellen, Endothelzellen und Makrophagen, die in einer organotypischen Anordnung an einem ALI mit mittlerer Perfusion der Endothelschleimhaut kultiviert werden. Zellen verschiedener Schichten exprimieren spezifische Zellmarkerproteine wie E-Cadherin, ein kalziumabhängiges Adhäsionsmolekül von Lungenepithelzellen, das für die Etablierung.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Cellcounting chamber slides (Countess)	Invitrogen	C10283
Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril	Greiner Bio-One	662 160
Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril	Greiner Bio-One	657 160
Coverslips (24x40mm; #1.5)	Menzel-Gläser	15747592
Eco wipes	Dr. Schuhmacher	00-915-REW10003-01
Eppies 2.0	Sarstedt	72.691
Eppis 0.5	Sarstedt	72.699
Eppis 1.5	Sarstedt	72.690.001
Falcons 15mL	Greiner Bio-One	188 271-TRI
Falcons 50mL	Greiner Bio-One	227 261-TRI
Gauze swab	Noba	PZN 2417767
Gloves Nitril 3000	Meditrade	1280
Microscope slides	Menzel-Gläser	AAAA000001##12E
Multiwell Plates 24 Well, sterile	Greiner Bio-One	662 160
Pasteur pipettes (glass) 150mm	Assistent	40567001
Pasteur pipettes (glass) 230mm	Assistent	40567002
Round-bottom tubes (PS, 5mL)	Falcon	352052
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm	Sarstedt	85.1637.235
Scalpels	Dahlhausen	11.000.00.715
Serological pipettes 10mL	Greiner Bio-One	607 160-TRI
Serological pipettes 25mL	Greiner Bio-One	760 160-TRI
Serological pipettes 2mL	Greiner Bio-One	710 160-TRI
Serological pipettes 50mL	Greiner Bio-One	768 160-TRI
Serological pipettes 5mL	Greiner Bio-One	606 160-TRI
S-Monovette, 7,5ml Z-Gel	Sarstedt	1.1602
S-Monovette, 9,0ml K3E	Sarstedt	02.1066.001
Softasept N	Braun	3887138
T25 flask	Greiner Bio-One	690 960
Tips sterile 10µL	Greiner Bio-One	771 261
Tips sterile 1250µL	Greiner Bio-One	750 261
Tips sterile 300µL	Greiner Bio-One	738 261
Tips unsterile 10µL	Greiner Bio-One	765 290
Tips unsterile 1000µL	Greiner Bio-One	739 291
Tips unsterile 200µL	Greiner Bio-One	686 290
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)	Roth	K343.1
Chemicals
Descosept AF	Dr. Schuhmacher	N-20338
Ethanol 96%	Nordbrand-Nordhausen	410
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa)	Sigma Aldrich	FD4-100MG
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023
Methanol	VWR	20847.295
Saponin	Fluka	47036
Tergazyme	Alconox	1304-1
Cell culture
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG
Dexametason	Sigma-Aldrich	D4902
DPBS (-/-)	Lonza	BE17-516F
DPBS (+/+)	Lonza	BE17-513F
EDTA solution	Sigma-Aldrich	E788S
Endothelial Cell Growth Medium	Promocell	C-22020
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix	Promocell	C-39225
Fetal bovine Serum	Sigma-Aldrich	E2129-10g
H441	ATCC
Human recombinant GM-CSF	Peprotech	300-30
Lidocain	Sigma-Aldrich	L5647-15G
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122 /-163
RPMI	Gibco	72400047
Trypane blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282
Trypsin	Gibco	15090-046
Primary antibodies
Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat)	BD	610252
CD68 (rabbit)	CellSignaling	76437
E-Cadherin (goat)	R&D	AF748
SP-A (mouse)	Abcam	ab51891
Secondary antibodies
AF488 (donkey anti mouse)	Invitrogen	R37114
AF647 (donkey anti mouse)	invitrogen	A31571
AF647 (donkey anti rabbit)	Invitrogen	A31573
Cy3 (donkey anti goat)	jackson research	705-165-147
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
Microfluidic
Chip	Dynamic 42	BC002
Male Luer Lock (small)	ChipShop	09-0503-0270-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, green	Microfluidic chipshop	09-0558-0336-11
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque	Microfluidic chipshop	09-0556-0336-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, red	Microfluidic chipshop	09-0557-0336-10
Plugs	Cole Parmer	GZ-45555-56
Reservoir 4.5mL	ChipShop	16-0613-0233-09
Tubing	Dynamic 42	ST001
Equipment
Autoclave	Tuttnauer	5075 ELV
Centrifuge	Eppendorf	5424
CO2 Incubator	Heracell	150i
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227
Flowcytometer	BD	FACS Canto II
Freezer (-20 °C)	Liebherr	LCexv 4010
Freezer (-80 °C)	Heraeus	Herafreeze HFU 686
Fridge	Liebherr	LCexv 4010
Heraeus Multifuge	Thermo Scientific	X3R
Microscope	Leica	DM IL LED
Orbital shaker	Heidolph	Reax2000
Peristaltic pump	REGLO Digital MS-4/12	ISM597D
Pipettes 10µL	Eppendorf Research plus	3123000020
Pipettes 100µL	Eppendorf Research plus	3123000047
Pipettes 1000µL	Eppendorf Research plus	3123000063
Pipettes 2.5µL	Eppendorf Research plus	3123000012
Pipettes 20µL	Eppendorf Research plus	3123000039
Pipettes 200µL	Eppendorf Research plus	3123000055
Scale	Sartorius	6101
Scale	Sartorius	TE1245
Sterile bench	Kojair	Biowizard SL-130
Waterbath	Julabo	SW-20C
Fluorescence Microscope Setup
Apotome.2	Zeiss
Illumination device	Zeiss	HXP 120 C
Microscope	Zeiss	Axio Observer 5
Optical Sectioning	Zeiss	ApoTome
Power Supply Microscope	Zeiss	Eplax Vp232
Software
ZEN Blue Edition	Zeiss