Immunkompetentes Alveolen-on-Chip-Modell zur Untersuchung der Immunantworten der Alveolarschleimhaut

Zusammenfassung

Lung-on-Chip-Modelle übertreffen herkömmliche 2D-Kulturen, indem sie die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und die Perfusion der Endothelzellen nachahmen und den Blutfluss und den Nährstoffaustausch simulieren, die für lungenphysiologische Studien entscheidend sind. Dies erhöht die Relevanz der Lungenforschung und bietet eine dynamische, physiologisch genaue Umgebung, um das Verständnis und die Behandlung von Atemwegsinfektionen zu verbessern.

Zusammenfassung

Wir stellen ein fortschrittliches immunkompetentes Lung-on-Chip-Modell vor, das die Struktur und Funktion der menschlichen Alveolen replizieren soll. Dieses innovative Modell verwendet einen mikrofluidisch durchbluteten Biochip, der eine Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche unterstützt, die die Umgebung in den menschlichen Lungenbläschen nachahmt. Tissue Engineering wird verwendet, um wichtige zelluläre Komponenten wie Endothelzellen, Makrophagen und Epithelzellen zu integrieren, um ein repräsentatives Gewebemodell der Alveole zu erstellen. Das Modell ermöglicht es, die Immunantworten der Schleimhäute auf verschiedene Krankheitserreger, darunter Viren, Bakterien und Pilze, eingehend zu untersuchen und so unser Verständnis der Lungenimmunität zu verbessern. Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, Details für die Etablierung dieses Alveolen-on-Chip-Modells als robuste In-vitro-Plattform für Infektionsstudien bereitzustellen, die es den Forschern ermöglicht, die komplexen Wechselwirkungen zwischen Krankheitserregern und dem Immunsystem des Wirts in der pulmonalen Umgebung genau zu beobachten und zu analysieren. Dies wird durch die Anwendung mikrofluidischer Techniken erreicht, um wichtige physiologische Bedingungen der menschlichen Alveolen zu simulieren, einschließlich des Blutflusses und der biomechanischen Stimulation von Endothelzellen, sowie durch die Aufrechterhaltung einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche, die für die realistische Exposition von Epithelzellen gegenüber Luft entscheidend ist. Das Modellsystem ist mit einer Reihe von standardisierten Assays kompatibel, wie z. B. Immunfluoreszenzfärbung, Zytokinprofilierung und Koloniebildungseinheit (KBE)/Plaque-Analyse, was einen umfassenden Einblick in die Immundynamik während der Infektion ermöglicht. Der Alveolus-on-Chip besteht aus essentiellen Zelltypen, einschließlich humaner distaler Lungenepithelzellen (H441) und humaner Nabelvenendothelzellen (HUVECs), die durch poröse Polyethylenterephthalat-Membranen (PET) getrennt sind, wobei primäre Monozyten-abgeleitete Makrophagen strategisch zwischen der Epithel- und der Endothelschicht positioniert sind. Das Gewebemodell verbessert die Fähigkeit, die nuancierten Faktoren, die an der pulmonalen Immunantwort beteiligt sind, in vitro zu analysieren und zu analysieren. Als wertvolles Instrument soll es zur Weiterentwicklung der Lungenforschung beitragen, indem es ein genaueres und dynamischeres In-vitro-Modell für die Untersuchung der Pathogenese von Atemwegsinfektionen und die Erprobung potenzieller therapeutischer Interventionen bereitstellt.

Einleitung

Die menschliche Lunge spielt eine bemerkenswerte Rolle bei der Atmung und Immunabwehr, mit komplexen Wechselwirkungen zwischen den Immunantworten der Alveolarschleimhaut¹. Die Fähigkeit der Lungenbläschen, eine effiziente Immunantwort zu erzeugen, ist entscheidend für die Vorbeugung von Lungeninfektionen und die Sicherung der Lungengesundheit. Da die Lunge ständig einer Vielzahl potenzieller Risiken ausgesetzt ist, darunter Bakterien, Viren, Pilze, Allergien und Feinstaub, ist das Verständnis der Komplexität der Immunreaktionen der Alveolarschleimhaut entscheidend, um die Mechanismen hinter Atemwegsinfektionen, entzündlichen Erkrankungen und der Behandlung von Lungenerkrankungen zu entdecken¹.

Um infektions- und entzündungsbedingte Prozesse der Atemwege in vitro zu untersuchen, werden Modelle benötigt, die das alveoläre Milieu und die Immunantworten originalgetreu nachahmen können. 2D-Zellkulturen und tierische Module werden seit Jahrzehnten als unverzichtbare Werkzeuge für die biomedizinische Forschung zur Immunantwort der Lunge eingesetzt. Sie haben jedoch oft Grenzen in ihrem translationalen Potenzial für menschliche Situationen. Lung-on-Chip-Modelle können dazu beitragen, die Lücke zwischen traditionellen In-vitro- und In-vivo-Modellen zu schließen und einen neuartigen Ansatz zur Untersuchung humanspezifischer Immunantworten zu bieten ^2,3. Lung-on-Chip-Modelle können die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche nachahmen, die für Lungenzellen erforderlich ist, um physiologische Zustände der Atemwege zu rekapitulieren und ein genaueres und robusteres Gewebemodell zu entwickeln. Diese Kulturtechnik ermöglicht eine präzise Untersuchung der Zelldifferenzierung, -funktion und -reaktion auf Medikamente oder krankheitsbezogene Reize in vitro².

In dieser Studie stellen wir ein mikrofluidikbasiertes Modell der menschlichen Alveole als effektives Werkzeug zur Rekapitulation des menschlichen Alveolenmilieus vor, indem wir Perfusion anwenden, um den Blutfluss und die biomechanische Stimulation von Endothelzellen nachzuahmen und eine Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche mit Epithelzellen zu integrieren, die einer Luftphase^{ausgesetzt sind Phase 4}. Wir haben eine mikrofluidisch perfundierte Alveole auf Chip entwickelt, die die physikalische Struktur und die biologischen Wechselwirkungen der menschlichen Alveolen nachahmt, mit besonderem Fokus auf die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche. Diese Schnittstelle spielt eine entscheidende Rolle bei der Differenzierung von respiratorischen Epithelzellen, die für die genaue Modellierung des Lungenmilieus unerlässlich ist. Das Modell verwendet humane distale Lungenepithelzellen (H441) und humane Nabelvenendothelzellen (HUVECs), die durch poröse Polyethylenterephthalat (PET)-Membranen getrennt sind, wobei primäre Monozyten-abgeleitete Makrophagen zwischen den Zellschichten positioniert sind. Dieser Aufbau repliziert die komplizierte zelluläre Anordnung der Alveolen und ist entscheidend für die genaue Simulation der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche, die ein wesentlicher Faktor für die physiologische Funktion des Lungengewebes ist.

Die Logik hinter der Modellentwicklung erstreckt sich auf die Integration sowohl zirkulierender als auch geweberesidenter Immunzellen. Dieser Ansatz ist so konzipiert, dass er die entzündliche Wirtsreaktion auf Atemwegsinfektionen beim Menschen genau nachahmt und eine dynamische Umgebung für die Untersuchung von Erreger-Wirt-Interaktionen bietet. Das Vorhandensein von Makrophagen ermöglicht die Untersuchung der unmittelbaren Immunreaktionen und ihrer Interaktion mit Krankheitserregern, was die erste Verteidigungslinie gegen Atemwegsinfektionen darstellt. Darüber hinaus ermöglicht das Design der Biochip-Plattform eine bequeme und präzise Manipulation sowohl biophysikalischer als auch biochemischer Hinweise, was für die Replikation der Alveolenfunktion in vitro von entscheidender Bedeutung ist. Diese Flexibilität ist entscheidend für die Analyse der Faktoren, die zu menschlichen Infektionen beitragen, und ermöglicht es den Forschern, die Bedingungen an verschiedene Krankheitszustände anzupassen oder potenzielle therapeutische Interventionen zu testen. Die Kompatibilität der Plattform mit mehreren Auslesetechnologien, einschließlich fortschrittlicher Mikroskopie, mikrobiologischer Analysen und biochemischer Abwasseranalyse, erhöht ihren Nutzen. Diese Fähigkeiten ermöglichen eine umfassende Bewertung der Gewebereaktion auf Infektionen, einschließlich der Bewertung des zellulären Verhaltens, der Proliferation von Krankheitserregern und der Wirksamkeit von Immunantworten.

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll und Techniken zur Erstellung und Nutzung eines humanen Alveolen-on-Chip-Modells, das sich auf die Replikation der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und die Integration von Immunzellen zur Untersuchung menschlicher Infektionen in vitro konzentriert.

Protokoll

HUVEC-Zellen werden aus Nabelschnüren isoliert und bis zur Passage 4 verwendet. Primäre Monozyten werden von gesunden Spendern aus Vollblut isoliert. Die Studie wurde von der Ethikkommission des Universitätsklinikums Jena, Jena, Deutschland genehmigt (3939-12/13). Laut der Erklärung von Helsinki gaben alle Personen, die Zellen für die Studie spendeten, ihre Einverständniserklärung.

1. Tag 1: Vorbereitung des Biochips

1. Die Biochips sind in verschiedenen Größen und Modellen erhältlich. Verwenden Sie für Experimente hier das Modell BC002. Legen Sie den Biochip in eine Petrischale aus Glas, füllen Sie die Schale und spülen Sie alle Hohlräume mit sterilem 70%igem Ethanol (EthOH). 45 min bei Raumtemperatur inkubieren. Spülen Sie anschließend die Kavitäten 2x mit sterilem ddH₂O. Entfernen Sie das ddH₂O.
2. Beschichten Sie die Biochip-Membran beider Kavitäten mit steriler Kollagen-IV-Lösung (0,5 mg/ml in 0,5 mM Essigsäure; verwenden Sie eine Konzentration von 1:100 in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die Magnesium und Calcium PBS (+/+) enthält), indem Sie die Kollagen-IV-Lösung mit einer 1.000-μl-Pipette mit blauen Spitzen vorsichtig durch beide Hohlräume spülen. 15 min bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
   HINWEIS: Die Verwendung einer 1.000-μl-Pipette mit Blaufilterspitzen (P1000) wird während des gesamten Protokolls empfohlen. Der Durchmesser der Öffnung der Filterspitze bedeckt die Öffnung der Anschlüsse, die die Kanäle verbinden, vollständig, wodurch das Eindringen von Luftblasen in den Chip vermieden wird.
3. Nach 30 min Inkubation spülen Sie die untere und obere Kammer 2x mit sterilem PBS (+/+), um das restliche Kollagen und die Essigsäure auszuspülen.
4. Bereiten Sie das EC-Medium vor, indem Sie 1:100 (v/v) Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml) hinzufügen. Füllen Sie die obere Kammer jeder Kavität mit 250 μl EC-Medium und die untere Kammer mit 150 μl EC-Medium.
5. Ernte HUVEC aus einem konfluenten T25-Kolben: Mit 5 mL Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Magnesium und Calcium PBS (-/-) waschen, 1 mL 0,25% Trypsin + 1 mM EDTA in PBS (-/-) zugeben und 3 min bei 37 °C inkubieren. Stoppen Sie die Trypsinaktivität, indem Sie 5 mL PBS (+/+) + 5 % FCS hinzufügen und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) bei 350 x g in einem konischen 50-ml-Röhrchen zentrifugieren. Den Überstand entfernen und das Küvettenpellet in 1 ml EC-Medium resuspendieren.
6. Verwenden Sie eine serielle Verdünnung von 1:10, wenn Sie die Zellzählung durchführen. Geben Sie 10 μl des resuspendierten Zellpellets zu 90 μl Zellmedium. Kombinieren Sie die Proben sorgfältig. Verwenden Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 10 μl Trypanblau-Fleck. Verdünnen Sie die Zelllösung mit Trypanblau (1:1) unter Verwendung von Objektträgern der Zellzählkammern. Zählen Sie die Zellen entweder manuell mit einer Neubauer-Kammer oder mit einem automatisierten Zellzähler. Bestimmen Sie die Zellzahl und stellen Sie die Konzentration auf 0,4 x 10⁶ Zellen pro 200 μl ein.
7. Ersetzen Sie das Endothelzellmedium in der oberen Kammer des Biochips durch 200 μl EC-Medium, das suspendierte HUVECs enthält. Vorsichtig pipettieren, um die Bildung von Luftblasen in den Kanälen oder Kammern zu vermeiden. Stellen Sie die Petrischale aus Glas mit den Biochips bei 37 °C und 5 % CO₂ auf_.

2. Tag 2: Überprüfung der Zellschicht

1. Überprüfen Sie an Tag 2 visuell die Konfluenz der HUVEC-Zellschicht in der oberen Kammer. In der oberen Kammer wird das Medium mit 300 μl EC-Medium gewechselt. Vorsichtig pipettieren, um eine Ablösung der Zellen von der Membran zu vermeiden. Führen Sie den Medienaustausch täglich nach 24 Uhr durch. Stellen Sie die Petrischale aus Glas mit den Biochips wieder auf 37 °C und 5 % CO₂ ein.

3. Tag 3: Vorbereitung der unteren Kammer

1. Überprüfen Sie visuell die Konfluenz der Endothelzellschicht. Bestimmen Sie an dieser Stelle das Vorhandensein einer konfluenten Schicht und einer kopfsteinpflasterartigen Morphologie (Abbildung 1). In der oberen Kammer wird das Medium mit 300 μl EC-Medium gewechselt.
2. Bereiten Sie dann die untere Kammer für die Aussaat der Zellen vor, die die Epithelschicht bilden. Spülen Sie die untere Kammer vorsichtig mit 150 μl des RPMI-Mediums (fügen Sie 1:100 (v/v) Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml), 5 % fötales Kuhserum, 1 μM Dexamethason hinzu).
3. Für die untere Kammer werden 0,5 x 10⁶ H441-Zellen in 200 μl RPMI-Medium (RPMI) pro Kavität ausgeimpft.
4. Ernte von H441-Zellen
   1. Waschen Sie die Zellen einmal mit 5 mL PBS (-/-). Fügen Sie 2 ml 0,25% Trypsin + 1 mM EDTA in PBS (-/-) hinzu.
   2. Inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO₂. Die Inkubationszeit variiert je nach Konfluenz der Schicht. Innerhalb von 5-7 Minuten sollten sich die Zellen vollständig ablösen.
   3. Stoppen Sie die Trypsinaktivität mit 10 mL PBS (+/+) + 5% FBS, sammeln Sie die Zellen und zentrifugieren Sie 4 Minuten lang bei 200 x g .
   4. Entsorgen Sie nach der Zentrifugation den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml RPMI und zählen Sie.
   5. 0,5 x 10⁶ Zellen pro Kammer aussäen, indem die Zelllösung vorsichtig in die untere Kammer pipettiert wird. Schließen Sie alle Anschlüsse und drehen Sie den Biochip auf den Kopf, damit sich die Zellen an der PET-Membran anheften können. Bewahren Sie den Biochip auf dem Kopf auf und inkubieren Sie ihn über Nacht in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂.

4. Tag 4 - Tag 7: Erhaltung der Zellen und Ernte von Monozyten

1. Führen Sie täglich einen Medienwechsel in der oberen und unteren Kammer durch. Für die obere Kammer wird der Medienaustausch mit 300 μL EC-Medium durchgeführt.
2. Verwenden Sie 200 μl RPMI+ (RPMI-Medium plus 1:100 (v/v) Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml), 10 ng/mL GM-CSF, 10 % autologes humanes Serum, 1 μM Dexamethason) für die untere Kammer. Spülen Sie an Tag 7 die untere Kammer mit RPMI+, um den Hohlraum für die Aussaat von Monozyten vorzubereiten.
3. Saatgut 0,1 x 10⁶ Monozyten in 200 μl RPMI+ in der unteren Kammer.
4. Gewinnung von Monozyten
   1. Waschen Sie die Zellen mit 1 mL PBS (-/-) und inkubieren Sie sie 7 Minuten lang bei 37 °C in vorgewärmtem PBS (-/-) mit 4 mg/ml Lidocain + 5 mM EDTA bei 37 °C und 5 % CO₂.
   2. Sammeln Sie die Zellen und zentrifugieren Sie sie 7 Minuten lang bei 350 x g , resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml RPMI+ und zählen Sie. Platzieren Sie die Biochip-Ports nach unten, so dass die Zellen an der Membran anhaften.

5. Tag 8: Biochip-Perfusion

1. Stellen Sie zu diesem Zeitpunkt sicher, dass die Biochips bereit sind, an den Durchfluss angeschlossen und durchblutet zu werden. Bevor Sie mit der Perfusion beginnen, bereiten Sie einen leeren Inkubator vor und setzen Sie die Peristaltikpumpe hinein.
2. Perfusion der Biochips
   1. Bevor Sie den sterilisierten Schlauch an den Biochip anschließen, spülen Sie den Schlauch mit 200 μl PBS (+/+), gefolgt von 200 μl EC-Medium. Der Schlauch hat einen Innendurchmesser von 0,5 mm, bestehend aus längeren (20 cm) und kürzeren (12 cm) Seiten, die durch zwei peristaltische Pumpenstopfen geteilt sind. Legen Sie die Schläuche beiseite und bereiten Sie die Behälter für das Medium vor.
   2. Führen Sie einen Medienaustausch in der oberen und unteren Kammer durch, indem Sie diese mit dem jeweils frisch zubereiteten Zellkulturmedium spülen.
   3. Setzen Sie das Reservoir auf der Auslassseite des Biochips ein und verbinden Sie das Reservoir mit dem Schlauch mit dem Einlass des Biochips (Abbildung 2). Verbinden Sie den Schlauch mit dem Reservoir und dem Biochip so, dass zwischen dem Reservoir und dem Biochip eine kreisförmige Mediumperfusion entsteht.
   4. Sobald alles an die Anschlüsse angeschlossen ist, füllen Sie den Behälter mit einem 500 μl EC-Medium auf. Verbinden Sie den Biochip mit dem Schlauch an einer Perfusionsrate mit einer Durchflussrate von 21 μL/min (Abbildung 2). Beobachten Sie während der ersten 15 Minuten der Perfusion genau, ob sich Blasen einfügen. Führen Sie täglich einen Mediumwechsel in beiden Kammern durch.

6. Tag 9 - Tag 11: Etablierung einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche

1. Stoppen Sie die Perfusion, leeren Sie die Reservoire und füllen Sie sie unter einem sterilen Sicherheitsschrank mit frisch zubereitetem Medium auf. Pipettieren Sie 500 μl EC-Medium in die Reservoire und spülen Sie die untere Kammer vorsichtig mit 200 μl RPMI+. Beginnen Sie die Perfusion wieder mit einer Perfusionsrate von 21 μL/min.
2. Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI)
   1. Legen Sie ALI von Tag 12 bis zum Ende des Experiments (Tag 14) fest. Während der ALI-Kultur die Epithelzellen der Luft aussetzen.
   2. Um die ALI-Kultur zu etablieren, bereiten Sie ein neues Gefäßmedium EC vor (fügen Sie 1:100 (v/v) Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml), 10 ng/ml GM-CSF, 20 % autologes humanes Serum, 1 μM Dexamethason hinzu), um alle Zelltypen im Chip zu erhalten. Zu diesem Zeitpunkt enthält das Medium eine höhere Konzentration an AS (20%).
   3. Öffnen Sie die Stopfen an der unteren Kammer unter einem sterilen Sicherheitsschrank und saugen Sie das Medium vorsichtig auf, bis eine Luftblase sichtbar ist, wie in Abbildung 3 gezeigt. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Flüssigkeit aus dem Kanal und der Kammer entfernt wird, und schließen Sie die Öffnungen vorsichtig.
   4. Füllen Sie die Reservoire mit EC-Medium (-/-) und setzen Sie die Perfusionskultur mit einer Flussrate von 21 μL/min fort. Wechseln Sie das Medium bis zum 14. Tag nur in der oberen Kammer und halten Sie die Epithelzellen in der unteren Kammer nur mit Luft.

7. Tag 14: Gewebeentnahme und -analyse

1. Trennen Sie den Biochip von der Strömung. Stecken Sie den Schlauch aus und prüfen Sie am Mikroskop die Zellkonfluenz. Aufgrund der Luft in der unteren Kammer können die Zellschichten verschwommen und schwer sichtbar erscheinen. Zu diesem Zeitpunkt ist das Modell bereit für weitere Experimente.
2. Fixierung und Färbung von Gewebe im Biochip
   1. Waschen Sie die Kavitäten mit PBS (+/+), um das Zellkulturmedium zu entfernen. Pipettieren Sie 300 μl 4 % Paraformaldehyd (PFA), gelöst in PBS (-/-), in die obere Kammer und 200 μl in die untere Kammer und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei RT.
      HINWEIS: Wenn Sie mit Fixierchemikalien wie PFA arbeiten, verwenden Sie einen Abzug. Sammeln und entsorgen Sie den Abfall entsprechend.
   2. Waschen Sie die Kammern 3x mit PBS (+/+). Lagern Sie die Biochips nach der Fixierung bei 4 °C oder verwenden Sie sie direkt für die Immunfluoreszenzfärbung von Zellen.
   3. Für die Permeabilisierung pipettieren Sie 300 μl 0,25 % Triton X-100 in PBS (+/+). 30 Minuten bei RT inkubieren.
   4. Nach der Inkubation werden beide Kammern mit PBS (+/+) gewaschen und in beiden Kammern 300 μl 3 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS (+/+) pipettiert. 1 h bei RT inkubieren.
   5. Bereiten Sie in der Zwischenzeit das Antikörperpanel für die Immunfluoreszenzfärbung vor. Um das Antikörperpanel für die Immunfluoreszenzfärbung vorzubereiten, wurde ein Röhrchen mit einer ausreichenden Menge von 3% BSA aufgestellt, um die Antikörper zu verdünnen. Verwenden Sie 50 μl Antikörperverdünnungen für jede Membran. Verwenden Sie ein Verdünnungsverhältnis von 1:100 für primäre Antikörper-Panels und 1:200 für sekundäre Antikörper-Panels. Bereiten Sie zusätzlich für das sekundäre Antikörperpanel DAPI in einem Verdünnungsverhältnis von 1:2.000 vor. Entsprechende Antikörper finden Sie unter (Tabelle 1).
   6. Um direkt an die Zellen innerhalb des Biochips zu gelangen, muss die Klebefolie entfernt werden. Um die mikrofluidischen Kammern zu öffnen, machen Sie einen exakten Schnitt quer über die Außenseite des Hohlraums und entfernen Sie die Klebefolie. Schneiden Sie die Membran heraus, indem Sie die mit dem Biochip versiegelten Ränder mit dem Skalpell entfernen.
      HINWEIS: Arbeiten Sie während dieses Schritts präzise und genau, um Membranschäden und Verletzungen durch die Schärfe des Skalpells zu vermeiden.
   7. Nachdem Sie die Membran vom Biochip gelöst haben, teilen Sie die Membran in zwei Teile. Sammeln Sie die Membranstücke mit einer Pinzette und legen Sie sie zum Färben auf einen mikroskopisch kleinen Objektträger.
   8. 50 μl Antikörperlösung pro Membranstück pipettieren. Über Nacht bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.
   9. Legen Sie die Membran nach der Inkubation in 500 μl PBS (-/-) in eine 24-Well-Platte und waschen Sie die Membran 3x für jeweils 5 min in PBS (+/+). Nach dem Waschen 50 μl Sekundärantikörperlösung pipettieren und 1 h bei RT lichtgeschützt inkubieren.
   10. Waschen Sie die Membran 3x für jeweils 5 min mit PBS (+/+). Bereiten Sie in der Zwischenzeit die mikroskopischen Objektträger für das Experiment vor und beschriften Sie sie. Geben Sie einen Tropfen Einbettmedium auf die Schiene und platzieren Sie die entsprechende Membran. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Membranen. Geben Sie zum Schluss noch einen Tropfen des Eindeckmediums auf die Oberseite der Membran und verwenden Sie ein Deckglas. Bei 4 °C lagern.

Ergebnisse

Eine Untersuchung morphologischer Veränderungen und der Expression von Markerproteinen könnte mittels Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt werden. Nach 14-tägiger Co-Kultivierung werden die Gefäß- und Epithelseite auf die Expression der jeweiligen Zellmarker analysiert. Diese Methode ist nützlich für die Untersuchung der Wechselwirkungen und der Integrität von vaskulären und epithelialen Komponenten, was für die Krankheitsmodellierung als funktionelle biologische Auslesung im Zusammenhang mit Infektionen uner...

Diskussion

Das Alveolus-on-Chip-Modell stellt ein mehrschichtiges Gewebemodell der menschlichen Alveole dar, das essentielle Zelltypen der unteren Atemwege integriert, einschließlich Lungenepithelzellen, Endothelzellen und Makrophagen, die in einer organotypischen Anordnung an einem ALI mit mittlerer Perfusion der Endothelschleimhaut kultiviert werden. Zellen verschiedener Schichten exprimieren spezifische Zellmarkerproteine wie E-Cadherin, ein kalziumabhängiges Adhäsionsmolekül von Lungenepithelzellen, das für die Etablierung...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Cellcounting chamber slides (Countess)	Invitrogen	C10283
Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril	Greiner Bio-One	662 160
Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril	Greiner Bio-One	657 160
Coverslips (24x40mm; #1.5)	Menzel-Gläser	15747592
Eco wipes	Dr. Schuhmacher	00-915-REW10003-01
Eppies 2.0	Sarstedt	72.691
Eppis 0.5	Sarstedt	72.699
Eppis 1.5	Sarstedt	72.690.001
Falcons 15mL	Greiner Bio-One	188 271-TRI
Falcons 50mL	Greiner Bio-One	227 261-TRI
Gauze swab	Noba	PZN 2417767
Gloves Nitril 3000	Meditrade	1280
Microscope slides	Menzel-Gläser	AAAA000001##12E
Multiwell Plates 24 Well, sterile	Greiner Bio-One	662 160
Pasteur pipettes (glass) 150mm	Assistent	40567001
Pasteur pipettes (glass) 230mm	Assistent	40567002
Round-bottom tubes (PS, 5mL)	Falcon	352052
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm	Sarstedt	85.1637.235
Scalpels	Dahlhausen	11.000.00.715
Serological pipettes 10mL	Greiner Bio-One	607 160-TRI
Serological pipettes 25mL	Greiner Bio-One	760 160-TRI
Serological pipettes 2mL	Greiner Bio-One	710 160-TRI
Serological pipettes 50mL	Greiner Bio-One	768 160-TRI
Serological pipettes 5mL	Greiner Bio-One	606 160-TRI
S-Monovette, 7,5ml Z-Gel	Sarstedt	1.1602
S-Monovette, 9,0ml K3E	Sarstedt	02.1066.001
Softasept N	Braun	3887138
T25 flask	Greiner Bio-One	690 960
Tips sterile 10µL	Greiner Bio-One	771 261
Tips sterile 1250µL	Greiner Bio-One	750 261
Tips sterile 300µL	Greiner Bio-One	738 261
Tips unsterile 10µL	Greiner Bio-One	765 290
Tips unsterile 1000µL	Greiner Bio-One	739 291
Tips unsterile 200µL	Greiner Bio-One	686 290
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)	Roth	K343.1
Chemicals
Descosept AF	Dr. Schuhmacher	N-20338
Ethanol 96%	Nordbrand-Nordhausen	410
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa)	Sigma Aldrich	FD4-100MG
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023
Methanol	VWR	20847.295
Saponin	Fluka	47036
Tergazyme	Alconox	1304-1
Cell culture
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG
Dexametason	Sigma-Aldrich	D4902
DPBS (-/-)	Lonza	BE17-516F
DPBS (+/+)	Lonza	BE17-513F
EDTA solution	Sigma-Aldrich	E788S
Endothelial Cell Growth Medium	Promocell	C-22020
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix	Promocell	C-39225
Fetal bovine Serum	Sigma-Aldrich	E2129-10g
H441	ATCC
Human recombinant GM-CSF	Peprotech	300-30
Lidocain	Sigma-Aldrich	L5647-15G
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122 /-163
RPMI	Gibco	72400047
Trypane blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282
Trypsin	Gibco	15090-046
Primary antibodies
Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat)	BD	610252
CD68 (rabbit)	CellSignaling	76437
E-Cadherin (goat)	R&D	AF748
SP-A (mouse)	Abcam	ab51891
Secondary antibodies
AF488 (donkey anti mouse)	Invitrogen	R37114
AF647 (donkey anti mouse)	invitrogen	A31571
AF647 (donkey anti rabbit)	Invitrogen	A31573
Cy3 (donkey anti goat)	jackson research	705-165-147
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
Microfluidic
Chip	Dynamic 42	BC002
Male Luer Lock (small)	ChipShop	09-0503-0270-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, green	Microfluidic chipshop	09-0558-0336-11
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque	Microfluidic chipshop	09-0556-0336-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, red	Microfluidic chipshop	09-0557-0336-10
Plugs	Cole Parmer	GZ-45555-56
Reservoir 4.5mL	ChipShop	16-0613-0233-09
Tubing	Dynamic 42	ST001
Equipment
Autoclave	Tuttnauer	5075 ELV
Centrifuge	Eppendorf	5424
CO2 Incubator	Heracell	150i
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227
Flowcytometer	BD	FACS Canto II
Freezer (-20 °C)	Liebherr	LCexv 4010
Freezer (-80 °C)	Heraeus	Herafreeze HFU 686
Fridge	Liebherr	LCexv 4010
Heraeus Multifuge	Thermo Scientific	X3R
Microscope	Leica	DM IL LED
Orbital shaker	Heidolph	Reax2000
Peristaltic pump	REGLO Digital MS-4/12	ISM597D
Pipettes 10µL	Eppendorf Research plus	3123000020
Pipettes 100µL	Eppendorf Research plus	3123000047
Pipettes 1000µL	Eppendorf Research plus	3123000063
Pipettes 2.5µL	Eppendorf Research plus	3123000012
Pipettes 20µL	Eppendorf Research plus	3123000039
Pipettes 200µL	Eppendorf Research plus	3123000055
Scale	Sartorius	6101
Scale	Sartorius	TE1245
Sterile bench	Kojair	Biowizard SL-130
Waterbath	Julabo	SW-20C
Fluorescence Microscope Setup
Apotome.2	Zeiss
Illumination device	Zeiss	HXP 120 C
Microscope	Zeiss	Axio Observer 5
Optical Sectioning	Zeiss	ApoTome
Power Supply Microscope	Zeiss	Eplax Vp232
Software
ZEN Blue Edition	Zeiss