Alveolar mukozal immün yanıtları incelemek için immünokompetan alveol-çip üzerinde model

Özet

Çip üzerinde akciğer modelleri, hava-sıvı arayüzünü ve endotel hücre perfüzyonunu taklit ederek, akciğer fizyolojisi çalışmaları için çok önemli olan kan akışını ve besin değişimini simüle ederek geleneksel 2D kültürleri aşıyor. Bu, solunum yolu enfeksiyonlarının anlaşılmasını ve tedavisini ilerletmek için dinamik, fizyolojik olarak doğru bir ortam sunarak akciğer araştırmalarının alaka düzeyini artırır.

Özet

İnsan alveolar yapısını ve işlevini taklit etmek için tasarlanmış gelişmiş bir immün yetmezlikli çip üzerinde akciğer modelini tanıtıyoruz. Bu yenilikçi model, insan alveollerindeki ortamı taklit eden bir hava-sıvı arayüzünü destekleyen mikroakışkan perfüze bir biyoçip kullanır. Doku mühendisliği, alveollerin temsili bir doku modelini oluşturmak için endotel hücreleri, makrofajlar ve epitel hücreleri dahil olmak üzere temel hücresel bileşenleri entegre etmek için kullanılır. Model, virüsler, bakteriler ve mantarlar dahil olmak üzere çeşitli patojenlere karşı mukozal bağışıklık tepkilerinin derinlemesine incelenmesini kolaylaştırır ve böylece akciğer bağışıklığı anlayışımızı geliştirir. Bu protokolün birincil amacı, bu alveolün çip üzerinde modelini enfeksiyon çalışmaları için sağlam bir in vitro platform olarak kurmak için ayrıntılar sağlamak ve araştırmacıların pulmoner ortamda patojenler ve konakçının bağışıklık sistemi arasındaki karmaşık etkileşimleri yakından gözlemlemelerini ve analiz etmelerini sağlamaktır. Bu, epitel hücrelerinin havaya gerçekçi bir şekilde maruz kalması için çok önemli olan bir hava-sıvı arayüzünün korunmasının yanı sıra, kan akışı ve endotel hücrelerinin biyomekanik stimülasyonu dahil olmak üzere insan alveollerinin temel fizyolojik koşullarını simüle etmek için mikroakışkan tabanlı tekniklerin uygulanmasıyla elde edilir. Model sistemi, immünofloresan boyama, sitokin profili oluşturma ve koloni oluşturan birim (CFU)/plak analizi gibi bir dizi standartlaştırılmış testle uyumludur ve enfeksiyon sırasında bağışıklık dinamikleri hakkında kapsamlı bilgiler sağlar. Çip üzerinde alveol, gözenekli polietilen tereftalat (PET) zarları ile ayrılmış insan distal akciğer epitel hücreleri (H441) ve insan göbek veni endotel hücreleri (HUVEC'ler) dahil olmak üzere temel hücre tiplerinden oluşur ve birincil monositten türetilmiş makrofajlar epitel ve endotel katmanları arasında stratejik olarak konumlandırılır. Doku modeli, in vitro pulmoner immün yanıtlarda yer alan nüanslı faktörleri inceleme ve analiz etme yeteneğini geliştirir. Değerli bir araç olarak, solunum yolu enfeksiyonlarının patogenezini incelemek ve potansiyel terapötik müdahaleleri test etmek için daha doğru ve dinamik bir in vitro model sağlayarak akciğer araştırmalarının ilerlemesine katkıda bulunmalıdır.

Giriş

İnsan akciğeri, alveolar mukozanın bağışıklık tepkileri arasındaki karmaşık etkileşimlerle solunum ve bağışıklık savunmasında dikkate değer bir role sahiptir¹. Alveollerin etkili bir bağışıklık tepkisi oluşturma yeteneği, akciğer enfeksiyonlarını önlemek ve akciğer sağlığını güvence altına almak için hayati önem taşır. Akciğerler sürekli olarak bakteriler, virüsler, mantarlar, alerjiler ve partikül maddeler dahil olmak üzere çok çeşitli potansiyel risklere maruz kaldığından, alveolar mukozal immün yanıtların karmaşıklıklarını anlamak, solunum yolu enfeksiyonlarının, enflamatuar bozuklukların arkasındaki mekanizmaları keşfetmek ve pulmoner hasta....

Protokol

HUVEC hücreleri göbek kordonlarından izole edilir ve 4. pasaja kadar kullanılır. Primer monositler, tam kandan sağlıklı donörlerden izole edilir. Çalışma, Jena, Almanya'daki Jena Üniversite Hastanesi etik kurulu tarafından onaylanmıştır (3939-12/13). Helsinki Bildirgesi'ne göre, çalışma için hücre bağışlayan tüm bireyler bilgilendirilmiş onamlarını verdiler.

1. Gün 1: Biyoçipin hazırlanması

1. Biyoçipler farklı boyutlarda ve modellerde mevcuttur. Buradaki deneyler için BC002 modelini kullanın. Biyoçipi bir cam Petri kabına yerleştirin, kabı doldurun ve tüm boşlukları steril %70 etanol (EthOH) ile yıkayın. Oda sıcaklı....

Tartışmalar

Çip üzerinde alveol modeli, insan alveolünün çok katmanlı bir doku modelini temsil eder ve akciğer epitel hücreleri, endotel hücreleri ve makrofajlar dahil olmak üzere alt solunum yolunun temel hücre tiplerini entegre eder ve endotel astarının orta perfüzyonu ile bir ALI'de organotipik bir düzenlemede kültürlenir. Farklı katmanlardaki hücreler, hücreler arası epitel bariyerlerinin oluşturulmasında merkezi olan, akciğer epitel hücrelerinin kalsiyuma bağımlı bir adezyon molekülü olan E-kaderin.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Cellcounting chamber slides (Countess)	Invitrogen	C10283
Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril	Greiner Bio-One	662 160
Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril	Greiner Bio-One	657 160
Coverslips (24x40mm; #1.5)	Menzel-Gläser	15747592
Eco wipes	Dr. Schuhmacher	00-915-REW10003-01
Eppies 2.0	Sarstedt	72.691
Eppis 0.5	Sarstedt	72.699
Eppis 1.5	Sarstedt	72.690.001
Falcons 15mL	Greiner Bio-One	188 271-TRI
Falcons 50mL	Greiner Bio-One	227 261-TRI
Gauze swab	Noba	PZN 2417767
Gloves Nitril 3000	Meditrade	1280
Microscope slides	Menzel-Gläser	AAAA000001##12E
Multiwell Plates 24 Well, sterile	Greiner Bio-One	662 160
Pasteur pipettes (glass) 150mm	Assistent	40567001
Pasteur pipettes (glass) 230mm	Assistent	40567002
Round-bottom tubes (PS, 5mL)	Falcon	352052
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm	Sarstedt	85.1637.235
Scalpels	Dahlhausen	11.000.00.715
Serological pipettes 10mL	Greiner Bio-One	607 160-TRI
Serological pipettes 25mL	Greiner Bio-One	760 160-TRI
Serological pipettes 2mL	Greiner Bio-One	710 160-TRI
Serological pipettes 50mL	Greiner Bio-One	768 160-TRI
Serological pipettes 5mL	Greiner Bio-One	606 160-TRI
S-Monovette, 7,5ml Z-Gel	Sarstedt	1.1602
S-Monovette, 9,0ml K3E	Sarstedt	02.1066.001
Softasept N	Braun	3887138
T25 flask	Greiner Bio-One	690 960
Tips sterile 10µL	Greiner Bio-One	771 261
Tips sterile 1250µL	Greiner Bio-One	750 261
Tips sterile 300µL	Greiner Bio-One	738 261
Tips unsterile 10µL	Greiner Bio-One	765 290
Tips unsterile 1000µL	Greiner Bio-One	739 291
Tips unsterile 200µL	Greiner Bio-One	686 290
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)	Roth	K343.1
Chemicals
Descosept AF	Dr. Schuhmacher	N-20338
Ethanol 96%	Nordbrand-Nordhausen	410
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa)	Sigma Aldrich	FD4-100MG
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023
Methanol	VWR	20847.295
Saponin	Fluka	47036
Tergazyme	Alconox	1304-1
Cell culture
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG
Dexametason	Sigma-Aldrich	D4902
DPBS (-/-)	Lonza	BE17-516F
DPBS (+/+)	Lonza	BE17-513F
EDTA solution	Sigma-Aldrich	E788S
Endothelial Cell Growth Medium	Promocell	C-22020
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix	Promocell	C-39225
Fetal bovine Serum	Sigma-Aldrich	E2129-10g
H441	ATCC
Human recombinant GM-CSF	Peprotech	300-30
Lidocain	Sigma-Aldrich	L5647-15G
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122 /-163
RPMI	Gibco	72400047
Trypane blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282
Trypsin	Gibco	15090-046
Primary antibodies
Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat)	BD	610252
CD68 (rabbit)	CellSignaling	76437
E-Cadherin (goat)	R&D	AF748
SP-A (mouse)	Abcam	ab51891
Secondary antibodies
AF488 (donkey anti mouse)	Invitrogen	R37114
AF647 (donkey anti mouse)	invitrogen	A31571
AF647 (donkey anti rabbit)	Invitrogen	A31573
Cy3 (donkey anti goat)	jackson research	705-165-147
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
Microfluidic
Chip	Dynamic 42	BC002
Male Luer Lock (small)	ChipShop	09-0503-0270-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, green	Microfluidic chipshop	09-0558-0336-11
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque	Microfluidic chipshop	09-0556-0336-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, red	Microfluidic chipshop	09-0557-0336-10
Plugs	Cole Parmer	GZ-45555-56
Reservoir 4.5mL	ChipShop	16-0613-0233-09
Tubing	Dynamic 42	ST001
Equipment
Autoclave	Tuttnauer	5075 ELV
Centrifuge	Eppendorf	5424
CO2 Incubator	Heracell	150i
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227
Flowcytometer	BD	FACS Canto II
Freezer (-20 °C)	Liebherr	LCexv 4010
Freezer (-80 °C)	Heraeus	Herafreeze HFU 686
Fridge	Liebherr	LCexv 4010
Heraeus Multifuge	Thermo Scientific	X3R
Microscope	Leica	DM IL LED
Orbital shaker	Heidolph	Reax2000
Peristaltic pump	REGLO Digital MS-4/12	ISM597D
Pipettes 10µL	Eppendorf Research plus	3123000020
Pipettes 100µL	Eppendorf Research plus	3123000047
Pipettes 1000µL	Eppendorf Research plus	3123000063
Pipettes 2.5µL	Eppendorf Research plus	3123000012
Pipettes 20µL	Eppendorf Research plus	3123000039
Pipettes 200µL	Eppendorf Research plus	3123000055
Scale	Sartorius	6101
Scale	Sartorius	TE1245
Sterile bench	Kojair	Biowizard SL-130
Waterbath	Julabo	SW-20C
Fluorescence Microscope Setup
Apotome.2	Zeiss
Illumination device	Zeiss	HXP 120 C
Microscope	Zeiss	Axio Observer 5
Optical Sectioning	Zeiss	ApoTome
Power Supply Microscope	Zeiss	Eplax Vp232
Software
ZEN Blue Edition	Zeiss