Alveolar mukozal immün yanıtları incelemek için immünokompetan alveol-çip üzerinde model

Özet

Çip üzerinde akciğer modelleri, hava-sıvı arayüzünü ve endotel hücre perfüzyonunu taklit ederek, akciğer fizyolojisi çalışmaları için çok önemli olan kan akışını ve besin değişimini simüle ederek geleneksel 2D kültürleri aşıyor. Bu, solunum yolu enfeksiyonlarının anlaşılmasını ve tedavisini ilerletmek için dinamik, fizyolojik olarak doğru bir ortam sunarak akciğer araştırmalarının alaka düzeyini artırır.

Özet

İnsan alveolar yapısını ve işlevini taklit etmek için tasarlanmış gelişmiş bir immün yetmezlikli çip üzerinde akciğer modelini tanıtıyoruz. Bu yenilikçi model, insan alveollerindeki ortamı taklit eden bir hava-sıvı arayüzünü destekleyen mikroakışkan perfüze bir biyoçip kullanır. Doku mühendisliği, alveollerin temsili bir doku modelini oluşturmak için endotel hücreleri, makrofajlar ve epitel hücreleri dahil olmak üzere temel hücresel bileşenleri entegre etmek için kullanılır. Model, virüsler, bakteriler ve mantarlar dahil olmak üzere çeşitli patojenlere karşı mukozal bağışıklık tepkilerinin derinlemesine incelenmesini kolaylaştırır ve böylece akciğer bağışıklığı anlayışımızı geliştirir. Bu protokolün birincil amacı, bu alveolün çip üzerinde modelini enfeksiyon çalışmaları için sağlam bir in vitro platform olarak kurmak için ayrıntılar sağlamak ve araştırmacıların pulmoner ortamda patojenler ve konakçının bağışıklık sistemi arasındaki karmaşık etkileşimleri yakından gözlemlemelerini ve analiz etmelerini sağlamaktır. Bu, epitel hücrelerinin havaya gerçekçi bir şekilde maruz kalması için çok önemli olan bir hava-sıvı arayüzünün korunmasının yanı sıra, kan akışı ve endotel hücrelerinin biyomekanik stimülasyonu dahil olmak üzere insan alveollerinin temel fizyolojik koşullarını simüle etmek için mikroakışkan tabanlı tekniklerin uygulanmasıyla elde edilir. Model sistemi, immünofloresan boyama, sitokin profili oluşturma ve koloni oluşturan birim (CFU)/plak analizi gibi bir dizi standartlaştırılmış testle uyumludur ve enfeksiyon sırasında bağışıklık dinamikleri hakkında kapsamlı bilgiler sağlar. Çip üzerinde alveol, gözenekli polietilen tereftalat (PET) zarları ile ayrılmış insan distal akciğer epitel hücreleri (H441) ve insan göbek veni endotel hücreleri (HUVEC'ler) dahil olmak üzere temel hücre tiplerinden oluşur ve birincil monositten türetilmiş makrofajlar epitel ve endotel katmanları arasında stratejik olarak konumlandırılır. Doku modeli, in vitro pulmoner immün yanıtlarda yer alan nüanslı faktörleri inceleme ve analiz etme yeteneğini geliştirir. Değerli bir araç olarak, solunum yolu enfeksiyonlarının patogenezini incelemek ve potansiyel terapötik müdahaleleri test etmek için daha doğru ve dinamik bir in vitro model sağlayarak akciğer araştırmalarının ilerlemesine katkıda bulunmalıdır.

Giriş

İnsan akciğeri, alveolar mukozanın bağışıklık tepkileri arasındaki karmaşık etkileşimlerle solunum ve bağışıklık savunmasında dikkate değer bir role sahiptir¹. Alveollerin etkili bir bağışıklık tepkisi oluşturma yeteneği, akciğer enfeksiyonlarını önlemek ve akciğer sağlığını güvence altına almak için hayati önem taşır. Akciğerler sürekli olarak bakteriler, virüsler, mantarlar, alerjiler ve partikül maddeler dahil olmak üzere çok çeşitli potansiyel risklere maruz kaldığından, alveolar mukozal immün yanıtların karmaşıklıklarını anlamak, solunum yolu enfeksiyonlarının, enflamatuar bozuklukların arkasındaki mekanizmaları keşfetmek ve pulmoner hastalıkların tedavisi için kritik öneme sahiptir¹.

Solunum yollarının enfeksiyon ve inflamasyonla ilgili süreçlerini in vitro olarak incelemek için, alveolar ortamı ve immün yanıtları sadık bir şekilde taklit edebilecek modeller gereklidir. 2D hücre kültürü ve hayvan modülleri, akciğer bağışıklık tepkisi üzerine biyomedikal araştırmalar için temel araçlar olarak onlarca yıldır kullanılmaktadır. Bununla birlikte, genellikle insan durumlarına çeviri potansiyellerinde sınırlamaları vardır. Çip üzerinde akciğer modelleri, geleneksel in vitro ve in vivo modeller arasındaki boşluğu doldurmaya katkıda bulunabilir ve insana özgü bağışıklık tepkilerini incelemek için yeni bir yaklaşım sağlayabilir ^2,3. Çip üzerinde akciğer modelleri, akciğer hücrelerinin solunum yolunun fizyolojik koşullarını özetlemesi ve daha doğru ve sağlam bir doku modeli geliştirmesi için gerekli olan hava-sıvı arayüzünü taklit edebilir. Bu kültür tekniği, hücre farklılaşmasının, işleyişinin ve ilaçlara veya hastalıkla ilgili uyaranlara verilen yanıtların in vitro² hassas bir şekilde incelenmesini sağlar.

Bu çalışmada, kan akışını taklit etmek için perfüzyon ve endotel hücrelerinin biyomekanik stimülasyonunu uygulayarak ve hava fazı^4'e maruz kalan epitel hücreleri ile bir hava-sıvı arayüzü dahil ederek insan alveolünün mikroakışkan tabanlı bir modelini sunuyoruz. İnsan alveolünün fiziksel yapısını ve biyolojik etkileşimlerini taklit eden, özellikle hava-sıvı arayüzüne odaklanan mikroakışkan perfüze edilmiş bir çip üzerinde alveol geliştirdik. Bu arayüz, pulmoner ortamın doğru bir şekilde modellenmesi için gerekli olan solunum epitel hücrelerinin farklılaşmasında çok önemli bir rol oynar. Model, gözenekli polietilen tereftalat (PET) zarları ile ayrılan ve hücre katmanları arasına yerleştirilmiş birincil monosit türevi makrofajlar ile ayrılmış insan distal akciğer epitel hücreleri (H441) ve insan göbek veni endotel hücrelerini (HUVEC'ler) kullanır. Bu kurulum, alveolün karmaşık hücresel düzenlemesini kopyalar ve akciğer dokusunun fizyolojik işlevinde önemli bir faktör olan hava-sıvı arayüzünü doğru bir şekilde simüle etmek için kritik öneme sahiptir.

Model geliştirmenin arkasındaki mantık, hem dolaşımdaki hem de dokuda yerleşik bağışıklık hücrelerini entegre etmeye kadar uzanır. Bu yaklaşım, insan solunum yolu enfeksiyonlarına karşı inflamatuar konak yanıtını doğru bir şekilde taklit etmek ve patojen-konak etkileşimlerini incelemek için dinamik bir ortam sağlamak üzere tasarlanmıştır. Makrofajların varlığı, solunum yolu enfeksiyonlarına karşı ilk savunma hattını yansıtan ani bağışıklık tepkilerinin ve bunların patojenlerle etkileşimlerinin incelenmesine izin verir. Ayrıca, biyoçip platformunun tasarımı, alveol fonksiyonunu in vitro olarak çoğaltmak için çok önemli olan hem biyofiziksel hem de biyokimyasal ipuçlarının uygun ve hassas bir şekilde manipüle edilmesini kolaylaştırır. Bu esneklik, insan enfeksiyonlarına katkıda bulunan faktörlerin incelenmesinde, araştırmacıların çeşitli hastalık durumlarını yansıtacak şekilde koşulları ayarlamasına veya potansiyel terapötik müdahaleleri test etmesine olanak tanır. Platformun gelişmiş mikroskopi, mikrobiyolojik analizler ve biyokimyasal atık analizi dahil olmak üzere çoklu okuma teknolojileriyle uyumluluğu, faydasını artırır. Bu yetenekler, hücresel davranışın, patojen proliferasyonunun ve bağışıklık tepkilerinin etkinliğinin değerlendirilmesi dahil olmak üzere enfeksiyonlara doku yanıtının kapsamlı bir değerlendirmesine izin verir.

Hava-sıvı arayüzünü kopyalamaya ve insan enfeksiyonlarını in vitro olarak incelemek için bağışıklık hücrelerini entegre etmeye odaklanan bir çip üzerinde insan alveol modeli oluşturmak ve kullanmak için ayrıntılı bir protokol ve teknikler sunuyoruz.

Protokol

HUVEC hücreleri göbek kordonlarından izole edilir ve 4. pasaja kadar kullanılır. Primer monositler, tam kandan sağlıklı donörlerden izole edilir. Çalışma, Jena, Almanya'daki Jena Üniversite Hastanesi etik kurulu tarafından onaylanmıştır (3939-12/13). Helsinki Bildirgesi'ne göre, çalışma için hücre bağışlayan tüm bireyler bilgilendirilmiş onamlarını verdiler.

1. Gün 1: Biyoçipin hazırlanması

1. Biyoçipler farklı boyutlarda ve modellerde mevcuttur. Buradaki deneyler için BC002 modelini kullanın. Biyoçipi bir cam Petri kabına yerleştirin, kabı doldurun ve tüm boşlukları steril %70 etanol (EthOH) ile yıkayın. Oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Daha sonra, boşlukları 2x steril ddH₂O ile yıkayın. ddH₂O'yu çıkarın.
2. Her iki boşluğun biyoçip zarını steril kollajen IV çözeltisi ile kaplayın (0.5 mM asetik asit içinde 0.5 mg / mL; Dulbecco'nun magnezyum ve kalsiyum içeren fosfat tamponlu salininde 1:100 konsantrasyon kullanın PBS (+/+)) kollajen IV çözeltisini mavi uçlu 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak her iki boşluktan nazikçe akıtarak. 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de 15 dakika inkübe edin.
   NOT: Tüm protokol boyunca mavi filtreli (P1000) uçlu 1.000 μL'lik bir pipet kullanılması önerilir. Filtre ucunun açıklığının çapı, kanalları birbirine bağlayan portların açıklığını tamamen kaplar ve bu da hava kabarcıklarının çipe girmesini önler.
3. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, kalan kollajen ve asetik asidi temizlemek için alt ve üst bölmeleri 2x steril PBS (+/+) ile yıkayın.
4. 1:100 (h/v) Penisilin / Streptomisin (10.000 U / mL) ekleyerek EC ortamını hazırlayın. Her boşluğun üst haznesini 250 μL EC ortamı ve alt hazneyi 150 μL EC ortamı ile doldurun.
5. HUVEC'i birleşik bir T25 şişesinden hasat edin: Magnezyum ve kalsiyum PBS (-/-) içermeyen 5 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini ile yıkayın, PBS'de (-/-) 1 mL% 0.25 Tripsin + 1 mM EDTA ekleyin ve 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin. 5 mL PBS (+/+) +% 5 FCS ekleyerek tripsin aktivitesini durdurun ve 50 mL'lik konik bir tüpte oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 1 mL EC ortamında yeniden süspanse edin.
6. Hücre sayımı yaparken 1:10 seri seyreltme kullanın. 90 μL hücre ortamına 10 μL yeniden süspanse hücre peleti ekleyin. Örnekleri dikkatlice birleştirin. 10 μL tripan mavisi lekesi olan bir mikrosantrifüj tüpü kullanın. Hücre sayma odası slaytlarını kullanarak hücre çözeltisini tripan mavisi (1: 1) ile seyreltin. Hücreleri bir Neubauer Odası ile manuel olarak veya otomatik bir hücre sayacı ile sayın. Hücre sayılarını belirleyin ve konsantrasyonu 200 μL'de 0,4 x 10⁶ hücre olarak ayarlayın.
7. Biyoçipin üst odasındaki endotel hücre ortamını, askıya alınmış HUVEC'ler içeren 200 μL EC ortamı ile değiştirin. Kanallarda veya haznelerde hava kabarcıkları oluşmasını önlemek için nazikçe pipetleyin. Biyoçiplerin bulunduğu cam Petri kabını 37 °C ve %5 CO_2'ye yerleştirin_.

2. Gün 2: Hücre tabakasının kontrolü

1. 2. Günde, üst odadaki HUVEC hücre tabakasının birleşip birleşmediğini görsel olarak kontrol edin. 300 μL EC ortamı ile üst bölmede ortam değişimi gerçekleştirin. Hücrelerin zardan ayrılmasını önlemek için nazikçe pipetleyin. 24 saat sonra günlük medya alışverişi yapın. Biyoçiplerin bulunduğu cam Petri kabını 37 °C ve %5 CO_2'ye geri yerleştirin.

3. Gün 3: Alt odanın hazırlanması

1. Endotel hücreleri tabakasının birleşimini görsel olarak kontrol edin. Bu noktada, birleşik bir tabaka ve parke taşı benzeri morfolojinin varlığını belirleyin (Şekil 1). 300 μL EC ortamı ile üst bölmede ortam değişimi gerçekleştirin.
2. Daha sonra, epitel tabakasını oluşturan hücreleri tohumlamak için alt odayı hazırlayın. Alt hazneyi 150 μL RPMI ortamı ile nazikçe yıkayın (1:100 (h/h) Penisilin / Streptomisin (10.000 U / mL),% 5 fetal serumu, 1 μM deksametazon ekleyin).
3. Alt bölme için, boşluk başına 200 μL RPMI ortamında (RPMI) asılı kalan 0.5 x 10⁶ H441 hücresi tohumlayın.
4. H441 hücrelerinin toplanması
   1. Hücreleri 5 mL PBS (-/-) ile bir kez yıkayın. PBS'ye 2 mL% 0.25 Tripsin + 1 mM EDTA ekleyin (-/-).
   2. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de 5 dakika inkübe edin. Kuluçka süresi, katmanın birleştiğine bağlı olarak değişir. 5-7 dakika içinde hücreler tamamen ayrılmalıdır.
   3. Tripsin aktivitesini 10 mL PBS (+/+) +% 5 FBS ile durdurun, hücreleri toplayın ve 4 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
   4. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın, peleti 1 mL RPM'de yeniden süspanse edin ve sayın.
   5. Hücre çözeltisini alt hazneye nazikçe pipetleyerek hazne başına 0,5 x^{10 6} hücre tohumlayın. Tüm bağlantı noktalarını kapatın ve hücrelerin PET zarına yapışabilmesi için biyoçipi ters çevirin. Biyoçipi baş aşağı tutun ve gece boyunca 37 ° C ve% 5 CO_2'de bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.

4. Gün 4 - Gün7: Hücrelerin bakımı ve monositlerin toplanması

1. Üst ve alt haznede günlük orta değişimi gerçekleştirin. Üst hazne için, 300 μL EC ortamı ile ortam değişimini gerçekleştirin.
2. Alt hazne için 200 μL RPMI+ (RPMI ortamı artı 1:100 (h/h) Penisilin / Streptomisin (10.000 U / mL), 10 ng / mL GM-CSF,% 10 otolog insan serumu, 1 μM deksametazon) kullanın. 7. günde, monositleri tohumlamak için boşluğu hazırlamak için alt hazneyi RPMI+ ile yıkayın.
3. Tohum 0.1 x 10⁶ monosit, alt bölmede 200 μL RPMI+ içinde asılı kalır.
4. Monositlerin toplanması
   1. Hücreleri 1 mL PBS (-/-) ile yıkayın ve 37 ° C'de 4 mg / mL Lidokain + 5 mM EDTA ve% 5 CO₂ içeren önceden ısıtılmış PBS'de (-/-) 37 ° C'de 7 dakika inkübe edin.
   2. Hücreleri toplayın ve 7 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin, hücreleri 1 mL RPMI+ içinde yeniden süspanse edin ve sayın. Biyoçip portlarını, hücrelerin zara yapışması için aşağı bakacak şekilde yerleştirin.

5. Gün 8: Biyoçip perfüzyonu

1. Bu noktada, biyoçiplerin akışa bağlanmaya ve perfüze edilmeye hazır olduğundan emin olun. Perfüzyona başlamadan önce boş bir inkübatör hazırlayın ve peristaltik pompayı içine yerleştirin.
2. Biyoçiplerin perfüzyonu
   1. Sterilize edilmiş hortumu biyoçipe takmadan önce, hortumu 200 μL PBS (+/+) ve ardından 200 μL EC ortamı ile yıkayın. Borunun iç çapı 0,5 mm'dir ve daha uzun (20 cm) ve daha kısa (12 cm) kenarlardan oluşur ve iki peristaltik pompa durdurucusu ile bölünmüştür. Boruyu bir kenara koyun ve rezervuarları ortam için hazırlayın.
   2. Üst ve alt bölmelerde, ilgili taze hazırlanmış hücre kültürü ortamı ile yıkayarak ortam değişimi gerçekleştirin.
   3. Rezervuarı biyoçipin çıkış tarafına yerleştirin ve rezervuarı boru ile birlikte biyoçipin girişine bağlayın (Şekil 2). Hortumu rezervuara ve biyoçipe bağlayın, böylece rezervuar ile biyoçip arasında dairesel bir ortam perfüzyonu olur.
   4. Her şey portlara bağlandıktan sonra, rezervuarı 500 μL'lik bir EC ortamı ile doldurun. Biyoçipi, 21 μL/dk akış hızına sahip bir perfüzyon üzerindeki tüpe bağlayın (Şekil 2). Kabarcıkların yerleştirilmesi için perfüzyonun ilk 15 dakikası boyunca yakından gözlemleyin. Her iki odada da günlük olarak orta değişim gerçekleştirin.

6. Gün 9 - Gün 11: Hava-sıvı arayüzünün kurulması

1. Perfüzyonu durdurun, rezervuarları boşaltın ve steril bir güvenlik kabini altında taze hazırlanmış besiyeri ile yeniden doldurun. Rezervuarlara 500 μL EC ortamı pipetleyin ve alt hazneyi 200 μL RPMI+ ile nazikçe yıkayın. Perfüzyonu 21 μL/dk'lık bir perfüzyon hızıyla tekrar başlatın.
2. Hava Sıvı Arayüzü (ALI)
   1. ALI'yi 12. günden deneyin sonuna kadar (14. gün) kurun. ALI kültürü sırasında, epitel hücrelerini havaya maruz bırakın.
   2. ALI kültürünü oluşturmak için, çipteki tüm hücre tiplerini korumak için yeni bir vasküler ortam EC (1:100 (h/h) Penisilin / Streptomisin (10.000 U / mL), 10 ng / ml GM-CSF,% 20 otolog insan serumu, 1μM deksametazon ekleyin) hazırlayın. Bu noktada, ortam daha yüksek bir AS konsantrasyonu (% 20) içerir.
   3. Steril bir güvenlik kabininin altındaki alt bölmedeki tapaları açın ve Şekil 3'te gösterildiği gibi bir hava kabarcığı görünene kadar ortamı dikkatlice ıslatın. Kanaldaki ve haznedeki tüm sıvının çıkarıldığından emin olun ve portları dikkatlice kapatın.
   4. Rezervuarları EC (-/-) ortamı ile doldurun ve 21 μL/dk akış hızı ile perfüzyon kültürüne devam edin. 14. güne kadar sadece üst haznede besiyeri değiştirin ve epitel hücrelerini sadece hava ile alt haznede tutun.

7. Gün 14: Doku toplama ve analizi

1. Biyoçipi akıştan ayırın. Hortumu çıkarın ve mikroskopta hücre birleşmesi olup olmadığını kontrol edin. Alt odadaki hava nedeniyle, hücre katmanları bulanık görünebilir ve görselleştirilmesi zor olabilir. Bu noktada, model daha fazla deney için hazırdır.
2. Biyoçipte dokunun fiksasyonu ve boyanması
   1. Hücre kültürü ortamını çıkarmak için boşlukları PBS (+/+) ile yıkayın. PBS (-/-) içinde çözülmüş 300 μL %4 paraformaldehit (PFA) pipetleyin ve alt hazneye 200 μL pipetleyin ve RT'de 10 dakika inkübe edin.
      NOT: PFA gibi sabitleme kimyasallarıyla çalışırken çeker ocak kullanın. Atıkları uygun şekilde toplayın ve atın.
   2. Hazneleri 3x PBS (+/+) ile yıkayın. Fiksasyondan sonra, biyoçipleri 4 ° C'de saklayın veya doğrudan hücrelerin immünofloresan boyaması için kullanın.
   3. Geçirgenlik için, PBS'de (+/+) 300 μL% 0.25 Triton X-100 pipetleyin. RT'de 30 dakika inkübe edin.
   4. İnkübasyondan sonra, her iki odayı PBS (+/+) ile yıkayın ve her iki odadaki PBS'de (+/+) 300 μL% 3 Sığır serum albümini (BSA) pipetleyin. RT'de 1 saat inkübe edin.
   5. Bu arada, immünofloresan boyama için antikor panelini hazırlayın. Antikor panelini immünofloresan boyamaya hazırlamak için, antikorları seyreltmek için yeterli miktarda %3 BSA içeren bir tüp kuruldu. Her zar için 50 μL antikor dilüsyonları kullanın. Primer antikor panelleri için 1:100 ve sekonder antikor panelleri için 1:200 seyreltme oranı kullanın. Ek olarak, ikincil antikor paneli için DAPI'yi 1: 2.000 seyreltme oranında hazırlayın. Karşılık gelen antikorlar için bakınız (Tablo 1).
   6. Biyoçip içindeki hücrelere doğrudan erişmek için yapıştırma folyosunun çıkarılması gerekir. Mikroakışkan odalarını açmak için, boşluğun dışından tam bir kesim yapın ve yapıştırma folyosunu çıkarın. Neşter ile biyoçipe kapatılmış kenarları çıkararak zarı kesin.
      NOT: Neşterin keskinliğinden kaynaklanan herhangi bir zar hasarını ve yaralanmayı önlemek için bu adım sırasında hassas ve doğru bir şekilde çalışın.
   7. Zarı biyoçipten ayırdıktan sonra, zarı iki parçaya bölün. Membran parçalarını bir cımbızla toplayın ve boyama için mikroskobik bir slayt üzerine yerleştirin.
   8. Membran parçası başına 50 μL antikor çözeltisi pipetleyin. Gece boyunca 4 °C'de ışıktan korunarak inkübe edin.
   9. İnkübasyondan sonra, zarı 500 μL PBS'ye (-/-) 24 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve zarı 3x'i PBS'de (+/+) her biri 5 dakika boyunca yıkayın. Yıkadıktan sonra, 50 μL ikincil antikor solüsyonunu pipetleyin ve RT'de ışıktan korunarak 1 saat inkübe edin.
   10. Membranı PBS (+/+) 3x ile her biri 5 dakika boyunca yıkayın. Bu arada, deney için mikroskobik slaytları hazırlayın ve etiketleyin. Sürgünün üzerine bir damla montaj ortamı yerleştirin ve ilgili membranı yerleştirin. Bu adımı tüm membranlar için tekrarlayın. Sonunda, membranın üstüne bir damla daha montaj ortamı koyun ve bir kapak camı kullanın. 4 °C'de saklayın.

Sonuçlar

Morfolojik değişikliklerin ve işaretleyici proteinlerin ekspresyonunun incelenmesi, immünofloresan boyama kullanılarak gerçekleştirilebilir. 14 gün boyunca birlikte kültürlendikten sonra, vasküler ve epitel tarafları, ilgili hücre belirteçlerinin ekspresyonu için analiz edilir. Bu yöntem, enfeksiyonla ilgili fonksiyonel bir biyolojik okuma olarak hastalık modellemesi için gerekli olan vasküler ve epitel bileşenlerinin etkileşimlerini ve bütünlüğünü incelemek için kullanışlıdır. İmmünoflo...

Tartışmalar

Çip üzerinde alveol modeli, insan alveolünün çok katmanlı bir doku modelini temsil eder ve akciğer epitel hücreleri, endotel hücreleri ve makrofajlar dahil olmak üzere alt solunum yolunun temel hücre tiplerini entegre eder ve endotel astarının orta perfüzyonu ile bir ALI'de organotipik bir düzenlemede kültürlenir. Farklı katmanlardaki hücreler, hücreler arası epitel bariyerlerinin oluşturulmasında merkezi olan, akciğer epitel hücrelerinin kalsiyuma bağımlı bir adezyon molekülü olan E-kaderin...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Cellcounting chamber slides (Countess)	Invitrogen	C10283
Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril	Greiner Bio-One	662 160
Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril	Greiner Bio-One	657 160
Coverslips (24x40mm; #1.5)	Menzel-Gläser	15747592
Eco wipes	Dr. Schuhmacher	00-915-REW10003-01
Eppies 2.0	Sarstedt	72.691
Eppis 0.5	Sarstedt	72.699
Eppis 1.5	Sarstedt	72.690.001
Falcons 15mL	Greiner Bio-One	188 271-TRI
Falcons 50mL	Greiner Bio-One	227 261-TRI
Gauze swab	Noba	PZN 2417767
Gloves Nitril 3000	Meditrade	1280
Microscope slides	Menzel-Gläser	AAAA000001##12E
Multiwell Plates 24 Well, sterile	Greiner Bio-One	662 160
Pasteur pipettes (glass) 150mm	Assistent	40567001
Pasteur pipettes (glass) 230mm	Assistent	40567002
Round-bottom tubes (PS, 5mL)	Falcon	352052
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm	Sarstedt	85.1637.235
Scalpels	Dahlhausen	11.000.00.715
Serological pipettes 10mL	Greiner Bio-One	607 160-TRI
Serological pipettes 25mL	Greiner Bio-One	760 160-TRI
Serological pipettes 2mL	Greiner Bio-One	710 160-TRI
Serological pipettes 50mL	Greiner Bio-One	768 160-TRI
Serological pipettes 5mL	Greiner Bio-One	606 160-TRI
S-Monovette, 7,5ml Z-Gel	Sarstedt	1.1602
S-Monovette, 9,0ml K3E	Sarstedt	02.1066.001
Softasept N	Braun	3887138
T25 flask	Greiner Bio-One	690 960
Tips sterile 10µL	Greiner Bio-One	771 261
Tips sterile 1250µL	Greiner Bio-One	750 261
Tips sterile 300µL	Greiner Bio-One	738 261
Tips unsterile 10µL	Greiner Bio-One	765 290
Tips unsterile 1000µL	Greiner Bio-One	739 291
Tips unsterile 200µL	Greiner Bio-One	686 290
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)	Roth	K343.1
Chemicals
Descosept AF	Dr. Schuhmacher	N-20338
Ethanol 96%	Nordbrand-Nordhausen	410
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa)	Sigma Aldrich	FD4-100MG
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023
Methanol	VWR	20847.295
Saponin	Fluka	47036
Tergazyme	Alconox	1304-1
Cell culture
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG
Dexametason	Sigma-Aldrich	D4902
DPBS (-/-)	Lonza	BE17-516F
DPBS (+/+)	Lonza	BE17-513F
EDTA solution	Sigma-Aldrich	E788S
Endothelial Cell Growth Medium	Promocell	C-22020
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix	Promocell	C-39225
Fetal bovine Serum	Sigma-Aldrich	E2129-10g
H441	ATCC
Human recombinant GM-CSF	Peprotech	300-30
Lidocain	Sigma-Aldrich	L5647-15G
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122 /-163
RPMI	Gibco	72400047
Trypane blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282
Trypsin	Gibco	15090-046
Primary antibodies
Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat)	BD	610252
CD68 (rabbit)	CellSignaling	76437
E-Cadherin (goat)	R&D	AF748
SP-A (mouse)	Abcam	ab51891
Secondary antibodies
AF488 (donkey anti mouse)	Invitrogen	R37114
AF647 (donkey anti mouse)	invitrogen	A31571
AF647 (donkey anti rabbit)	Invitrogen	A31573
Cy3 (donkey anti goat)	jackson research	705-165-147
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
Microfluidic
Chip	Dynamic 42	BC002
Male Luer Lock (small)	ChipShop	09-0503-0270-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, green	Microfluidic chipshop	09-0558-0336-11
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque	Microfluidic chipshop	09-0556-0336-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, red	Microfluidic chipshop	09-0557-0336-10
Plugs	Cole Parmer	GZ-45555-56
Reservoir 4.5mL	ChipShop	16-0613-0233-09
Tubing	Dynamic 42	ST001
Equipment
Autoclave	Tuttnauer	5075 ELV
Centrifuge	Eppendorf	5424
CO2 Incubator	Heracell	150i
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227
Flowcytometer	BD	FACS Canto II
Freezer (-20 °C)	Liebherr	LCexv 4010
Freezer (-80 °C)	Heraeus	Herafreeze HFU 686
Fridge	Liebherr	LCexv 4010
Heraeus Multifuge	Thermo Scientific	X3R
Microscope	Leica	DM IL LED
Orbital shaker	Heidolph	Reax2000
Peristaltic pump	REGLO Digital MS-4/12	ISM597D
Pipettes 10µL	Eppendorf Research plus	3123000020
Pipettes 100µL	Eppendorf Research plus	3123000047
Pipettes 1000µL	Eppendorf Research plus	3123000063
Pipettes 2.5µL	Eppendorf Research plus	3123000012
Pipettes 20µL	Eppendorf Research plus	3123000039
Pipettes 200µL	Eppendorf Research plus	3123000055
Scale	Sartorius	6101
Scale	Sartorius	TE1245
Sterile bench	Kojair	Biowizard SL-130
Waterbath	Julabo	SW-20C
Fluorescence Microscope Setup
Apotome.2	Zeiss
Illumination device	Zeiss	HXP 120 C
Microscope	Zeiss	Axio Observer 5
Optical Sectioning	Zeiss	ApoTome
Power Supply Microscope	Zeiss	Eplax Vp232
Software
ZEN Blue Edition	Zeiss