הזרקה תוך-מצלמה בחולדות עם סיכון נמוך לתופעות לוואי

Summary

פרוטוקול זה מתאר טכניקה להזרקה תוך-מצלמה בחולדות באמצעות חתך מרכזי בקרנית ומנהרה ארוכה לתוך החדר הקדמי. שיטת הזרקה זו ממזערת את הסיכון לגרימת נזק לא מכוון לרקמות ובכך משפרת את הדיוק והשחזור.

Abstract

הזרקה intracameral היא שגרת ניהול סטנדרטית ברפואת עיניים. היישום של הזרקה תוך-מצלמה במכרסמים למחקר מאתגר בשל הממדים והאנטומיה המגבילים של העין, כולל נפח ההומור המימי הקטן, עקמומיות העדשה ועובי העדשה. נזק פוטנציאלי במהלך הזרקות intracameral מציג תופעות לוואי ושונות הניסוי. פרוטוקול זה מתאר הליך להזרקה תוך-מצלמה בחולדות, המאפשר דיוק ושחזור.

חולדות ספראג-דולי שימשו כמודלים ניסיוניים. מכיוון שמיקום העדשה בחולדות בולט לחדר הקדמי, הזרקה מהפריפריה, כפי שנעשה בבני אדם, היא שלילית. לכן, חתך נוצר באזור הקרנית המרכזי באמצעות להב סטילטו 31 מד 0.8 מ"מ כדי ליצור מנהרה אוטמת עצמית לתוך החדר הקדמי. חתך בזווית קרובה לדירה מאפשר ליצור מנהרה ארוכה, הממזערת את אובדן ההומור המימי והרדוד של החדר הקדמי. ננו-מחט 34 מד מוחדרת למנהרה להזרקה. הדבר מאפשר חדירה עם התנגדות חיכוך מינימלית ומונע נגיעה בעדשה. הזרקה של טריפאן-כחול מאפשרת הדמיה על ידי מיקרוסקופ חריץ את נוכחות הצבע בחדר הקדמי ולא לכלול דליפה. זמינות ביולוגית לשכבת האנדותל של הקרנית מודגמת על ידי הזרקת צבע Hoechst, אשר הכתים את גרעיני תאי האנדותל של הקרנית לאחר ההזרקה.

לסיכום, פרוטוקול זה מיישם נוהל להזרקה תוך-מצלמה מדויקת בחולדות. הליך זה עשוי לשמש למסירה תוך-מצלמה של תרופות ותרכובות שונות במודלים ניסיוניים של חולדות, מה שמגביר את היעילות והשחזור של מחקר עיניים.

Introduction

הזמינות הביולוגית של תרכובות המועברות על ידי מתן מקומי לפני השטח של העין מוגבלת מאוד, בדרך כלל <5%¹. תרכובות המנוהלות על ידי טיפות עיניים מסולקות בעיקר על ידי ניקוז, דמעות מושרה, תחלופת נוזל דמעות וספיגת הלחמית. בנוסף, חלחול התרכובות דרך משטח העין מוגבל מאוד על ידי מחסום הקרנית-לחמית ^1,2,3. הקרנית מורכבת משלוש שכבות עיקריות: האפיתל החיצוני ביותר, סטרומה הביניים והאנדותל הפנימי ביותר. אפיתל הקרנית השטחי מחובר על ידי צמתים הדוקים חזקים ויוצר התנגדות פארא-תאית גבוהה, המהווה את המחסום העיקרי לחדירות חומרים. שכבות אפיתל מרובות מגבילות עוד יותר את החלחול של מולקולות הידרופיליות וגדולות דרך החללים הבין-תאיים של אפיתל הקרנית. במקום האפיתל, הסטרומה מורכבת מסיבי קולגן ומכילה נקבוביות מימיות. בניגוד לאפיתל הקרנית, הסטרומה מאפשרת תנועה של תרופות הידרופיליות; עם זאת, הוא אטום מאוד לתרכובות ליפופיליות ^1,2,3. יחד, אפיתל הקרנית ושכבות הסטרומה מציגים מחסומי רקמות עיקריים המגבילים את ספיגת התרופות. אנדותל הקרנית אינו נחשב להגביל את העברת התרופות.

חלופה למסלול המסירה של הקרנית היא מסלול הלחמית. הלחמית היא שכבה מרובת אפיתל המכסה את הצד הפנימי של העפעפיים ואת החלק הקדמי של הסקלרה. הלחמית מאופיינת בצמתים הדוקים פחות מאשר אפיתל הקרנית, מה שמאפשר חדירות טובה יותר של תרופות הידרופיליות. עם זאת, וסקולריזציה של הלחמית גורמת לספיגה מערכתית של חלק גדול מהמולקולות המנוהלות, ושוב מגבילה מאוד את הזמינות הביולוגית של תרכובות המועברות לחדר הקדמי ^1,2. דרך יעילה לעקוף את מחסומי חדירות העין החיצונית היא לספק את התרופה ישירות לאזור המעניין. לדוגמה, הזרקה intravitreal נפוץ עבור משלוח לתוך הומור הזגוגית⁴. כמו כן, הזרקה intracameral משמש למסירה לתוך החדר הקדמי⁵. קביעת ריכוז יעיל בחדר הקדמי היא קריטית למצבים קליניים שונים, כגון טיפול בזיהום על ידי הזרקה תוך-מצלמה של אנטיביוטיקה וטיפולים אנטי דלקתיים לאחר הניתוח בניתוחי קטרקט. למרות היתרון של זמינות ביולוגית משופרת של חומרים המוענקת על ידי הזרקה תוך מצלמה, ישנם חששות בטיחות עיקריים שיש לקחת בחשבון. לדוגמה, הזרקת תרופה תוך-מצלמה עלולה לגרום ללחץ תוך עיני מוגבר, תסמונת מקטע קדמי רעיל ותסמונת הרס תאי אנדותל רעילים ^5,6. לכן, חיוני להעריך בזהירות במחקרים פרה-קליניים את היעילות והבטיחות של תרופות הניתנות על ידי זריקות intracameral כדי למקסם את יעילות הטיפול ולמזער תופעות לוואי פוטנציאליות בחולים.

מודלים ניסיוניים של בעלי חיים הם הכרחיים במחקרים פרה-קליניים כדי לחקור טיפולים חדשים. מכרסמים קטנים, כגון עכברים וחולדות, הם חיות המעבדה הנפוצות ביותר למטרות כאלה. בעלי חיים אלה מפגינים קווי דמיון רבים לאנטומיה ולפיזיולוגיה האנושית, ומספקים תובנות חשובות. יתר על כן, השימוש בהם הוא יתרון כלכלי בשל גודלם הקטן, קלות התחזוקה, ההריון המהיר והיכולת לייצר מספר גדול של צאצאים⁷.

למרות השימוש הנרחב במכרסמים קטנים במודלים של מחלות עיניים, ממדי העיניים והאנטומיה הייחודיים שלהם מציבים אתגרים משמעותיים במהלך מניפולציות ניסיוניות. לדוגמה, הליכים כמו זריקות תוך-מצלמה, שהם פשוטים יחסית בבני אדם, הופכים תובעניים מבחינה טכנית בעכברים ובחולדות. האתגרים נובעים מגורמים כמו הנפח הקטן של הומור מימי, העדשה הגדולה יחסית והלא גמישה, והמיקום והעקמומיות החסימתית של העדשה בתוך עיני המכרסמים (איור 1)⁸. אתגרים אלה מגבירים את הסיכון לנזק במהלך הזרקות תוך-מצלמה במכרסמים, מה שמוביל לתופעות לוואי אפשריות ומציג שונות ניסויית שיכולה להשפיע על תקפות מסקנות המחקר. במחקר שלנו, פיתחנו בהצלחה הליך להזרקה תוך-מצלמה בטוחה בחולדות. הטכניקה כוללת יצירת מנהרה ארוכה, שטוחה ואטומה עצמית בקרנית לתוך החדר הקדמי. שיטה זו לא רק מבטיחה דיוק אלא גם משפרת את יכולת השחזור הניסיונית, ומטפלת בבעיות הקשורות לטכניקות הזרקה במכרסמים קטנים.

איור 1: ייצוג סכמטי של מאפייני המקטע האנטומי הקדמי של חולדה ועיניים אנושיות. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

הניסויים בפרוטוקול אושרו על ידי ועדת ההיתרים הארצית - למדעי בעלי חיים ועומדים בהצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה. נקבות חולדות Sprague-Dawley, בגילאי 8-10 שבועות, שימשו במחקר הנוכחי ונחשפו למחזורי אור-חושך של 12/12 שעות. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. הכנת בעלי חיים

1. הכינו תערובת מרדימה של קטמין (80 מ"ג/ק"ג משקל גוף ב-0.8 מ"ל) וקסילזין (4 מ"ג/ק"ג משקל גוף ב-0.2 מ"ל) והזריקו אותה תוך צפקית בזריקה אחת כדי להרדים את החולדות.
2. להזריק משכך כאבים buprenorphine (0.03 מ"ג / ק"ג) intraperitoneally בזריקה אחת.
3. החל הרדמה אופתלמית מקומית 0.4% oxybuprocaine על שתי העיניים.

2. יצירת תעלת קרנית אוטמת עצמה

1. ייצוב העין על ידי החזקת לובן העין העליון בקו האמצע האנכי ליד הצומת הקורנאוסקרלי עם מלקחיים אופתלמיים כירורגיים.
2. תחת מיקרוסקופ כירורגי, הניחו להב סטילטו סטרילי בקוטר 0.8 מ"מ, 31 G באזור הקרנית הפארא-מרכזית בקו האמצע האנכי (מעל מרכז האישון) במצב שטוח בזווית קרובה ככל האפשר לאופקית (איור 2).
3. במצב זה, לנקב את הקרנית כדי לבצע חתך וליצור מנהרה ארוכה (2-3 מ"מ) עד שהיא חודרת לאזור המרכזי של החדר הקדמי. הימנעו מלגעת בעדשה (איור 2).
   הערה: מנהרה מוצלחת לא תגרום לדליפה של ההומור המימי והרידוד של החדר הקדמי.
4. יש למרוח 0.3% ofloxacin מקומי ו-0.1% dexamethasone על העין המוזרקת.
5. יש לבחון תחת מיקרוסקופ סדק באופן הבא.
   1. שימו לב לעומק החדר הקדמי של העין המוזרקת בהשוואה לעין שאינה מוזרקת.
      הערה: העומק צריך להיות דומה.
   2. שימו לב לעדשת העין המוזרקת בהשוואה לעין שאינה מוזרקת.
      הערה: העדשה צריכה להיות ברורה. האטימות עלולה לשקף נזק לעדשה במהלך ההליך הכירורגי.

איור 2: ייצוג סכמטי של הלהב וזווית החתך ומיקומו. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. אפשרות 1: הזרקה תוך-מצלמה של טריפאן כחול להערכת הזריקה המוצלחת לחדר הקדמי

1. יש להעמיס 5 μL של טריפאן כחול לתוך מזרק סטרילי של 10 μL זכוכית המילטון עם מחט קהה 34 G.
   הערה: הזרקת טריפאן כחול מתוארת כאמצעי להערכת הצלחת ההזרקה במהלך שלבי כיול המודל או ההתקנה. בהגדרות הניסוי, ניתן לטעון את המזרק בתמיסה של התרכובת הנבחרת.
2. הכנס את מחט המזרק הטעונה דרך התעלה שנוצרה בסעיף 2 לתא הקדמי.
3. יש להזריק ולהחזיק את המחט במקומה לאחר ההזרקה למשך 2-3 שניות עד שכל הנוזלים יתבהרו.
4. הסר את המחט על ידי שליפתה החוצה בעדינות ובאיטיות כדי למנוע דליפה מתעלת הקרנית.
5. יש לבחון תחת מיקרוסקופ חריץ. להעריך את עומק החדר הקדמי כדי למנוע רידוד ולאמת את נוכחותו של כחול טריפאן בחדר הקדמי.
6. יש לחזור על בדיקת החריץ לאחר 24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות.

4. אפשרות 2: הזרקה תוך-מצלמה של Hoechst להערכת הזמינות הביולוגית של חומר מוזרק לשכבת תאי האנדותל

1. יש להעמיס 5 μL של Hoechst לתוך מזרק המילטון סטרילי זכוכית 10 μL עם מחט קהה 34 G.
   הערה: הזרקת Hoechst מתוארת כאמצעי להערכת הזמינות הביולוגית של חומר מוזרק על ידי ספיגה לתוך שכבת תאי האנדותל והיא שימושית במהלך כיול המודל או שלבי ההתקנה. בהגדרות הניסוי, ניתן לטעון את המזרק בתמיסה של התרכובת הנבחרת.
2. הכנס את מחט המזרק הטעונה דרך התעלה שנוצרה בסעיף 2 לתא הקדמי.
3. יש להזריק ולהחזיק את המחט במקומה לאחר ההזרקה למשך 2-3 שניות עד שכל הנוזלים יתבהרו.
4. הסר את המחט על ידי שליפתה החוצה בעדינות ובאיטיות כדי למנוע דליפה מהחתך בתעלת הקרנית.
5. כ 15-20 דקות לאחר ההזרקה, להרדים את החולדות על ידי הזרקה intraperitoneal של 500 מ"ג / ק"ג נתרן pentobarbitone.
6. לחנך את שתי העיניים ולבודד קרניות. לאסוף את הקרנית שלא הוזרקה כבקרה.
7. יש להכתים את שתי הקרניות ב-0.5% Alizarin Red S בהתאם להוראות היצרן לזיהוי תאי אנדותל.
8. בחנו תחת מיקרוסקופ אור כדי לדמות את הצביעה האדומה-אליזרינית של תאי אנדותל ותחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לצפות בצביעת הוכסט, בהשוואה לקרנית שלא הוזרקה כבקרה.

תוצאות

לחולדות Sprague Dawley הוזרקו 5 μL של טריפאן כחול בהתאם לפרוטוקול שתואר לעיל. בדיקת מנורת חריץ מיד לאחר ההזרקה הראתה שהחדר היה מוכתם בכחול טריפאן, מה שמעיד על כך שהחומר המוזרק הגיע לחדר הקדמי (איור 3). יתר על כן, עומק החדר הקדמי היה שלם, מה שמרמז על כך שההזרקה לא גרמ?...

Discussion

מודלים של מחקר פרה-קליני צריכים לספק סביבה מבוקרת וניתנת לשחזור כדי להבטיח את האמינות והישימות של הממצאים. במחקר עיניים, מודלים של הזרקת עיניים משמשים בדרך כלל בהיבטי מחקר מגוונים, החל מהקמת מודלים של מחלות, בדיקת טיפולים חדשים והערכת תגובות לרקמות ותופעות לוואי אפשריו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin Red	Alpha Aesar	042040.5
Buprenorphine	Richter pharma	102047
Dexamethasone 0.1%	Fisher Pharmaceutical	393102-0413
Hamilton glass syringe 10 μL	Hamilton Co.	721711
Hoeschst	Merck	B2261
Ketamine	Bremer pharma GMBH (medimarket)	17889
Ofloxacin 0.3% eye drops	Allergan	E92170
Oxybuprocaine Hydrochloride 0.4%	Fisher Pharmaceutical	N/A
Pentobarbital sodium 200 mg/mL	CTS	N/A
Slit microscope	Haag-streit bern	b-90019115
Sprague-Dawley Rats	Envigo	N/A
Stiletto blade 31 G 0.8 mm	Tecfen medical (skymed)	QKN2808
Surgical microscope	Zeiss	OPMI-6 CFC
Trypan Blue	Sartorius	03-102-1B
Xylazine	Eurovet Animal Health	615648