Injeção intracameral em ratos com baixo risco de efeitos adversos

Resumo

Este protocolo descreve uma técnica para injeção intracameral em ratos usando uma incisão central na córnea e um longo túnel na câmara anterior. Este método de injeção minimiza o risco de induzir danos inadvertidos ao tecido e, assim, melhora a precisão e a reprodutibilidade.

Resumo

A injeção intracameral é uma rotina de administração padrão em oftalmologia. A aplicação da injeção intracameral em roedores para pesquisa é desafiadora devido às dimensões limitantes e anatomia do olho, incluindo o pequeno volume de humor aquoso, a curvatura do cristalino e a espessura do cristalino. Danos potenciais durante injeções intracamerais introduzem efeitos adversos e variabilidade experimental. Este protocolo descreve um procedimento para injeção intracameral em ratos, permitindo precisão e reprodutibilidade.

Ratos Sprague-Dawley foram usados como modelos experimentais. Como a posição do cristalino em ratos se projeta para a câmara anterior, a injeção da periferia, como feito em humanos, é desfavorável. Portanto, uma incisão é criada na região central da córnea usando uma lâmina de estilete de calibre 31 de 0,8 mm para formar um túnel autovedante na câmara anterior. Uma incisão em um ângulo próximo ao plano permite criar um túnel longo, o que minimiza a perda de humor aquoso e o raso da câmara anterior. Uma nanoagulha de calibre 34 é inserida no túnel para injeção. Isso permite a penetração com resistência mínima ao atrito e evita tocar na lente. A injeção de azul de tripano permite visualizar por microscopia de fenda a presença do corante na câmara anterior e excluir vazamentos. A biodisponibilidade para a camada endotelial da córnea é demonstrada pela injeção do corante Hoechst, que corou os núcleos das células endoteliais da córnea após a injeção.

Em conclusão, este protocolo implementa um procedimento para injeção intracameral precisa em ratos. Este procedimento pode ser usado para entrega intracameral de vários medicamentos e compostos em modelos experimentais de ratos, aumentando a eficiência e a reprodutibilidade da pesquisa oftalmológica.

Introdução

A biodisponibilidade dos compostos administrados por administração tópica à superfície do olho é muito limitada, normalmente <5%¹. Os compostos administrados por colírios são eliminados principalmente por drenagem, lacrimejamento induzido, renovação do fluido lacrimal e absorção conjuntival. Além disso, a permeação de compostos através da superfície ocular é altamente restrita pela barreira córnea-conjuntiva ^1,2,3. A córnea é composta por três camadas principais: o epitélio mais externo, o estroma intermediário e o endotélio mais interno. O epitélio superficial da córnea é interconectado por fortes junções apertadas e cria alta resistência paracelular, que é a principal barreira à permeabilidade da substância. Múltiplas camadas de epitélio limitam ainda mais a permeação de moléculas hidrofílicas e grandes através dos espaços intercelulares do epitélio da córnea. Sucedendo ao epitélio, o estroma é composto por fibras colágenas e contém poros aquosos. Em contraste com o epitélio da córnea, o estroma permite a movimentação de drogas hidrofílicas; no entanto, é muito impermeável a compostos lipofílicos ^1,2,3. Juntos, o epitélio da córnea e as camadas estromais apresentam grandes barreiras teciduais que limitam a absorção do fármaco. O endotélio da córnea não é considerado como restritivo do transporte de medicamentos.

Alternativa à via de entrega da córnea é a via conjuntival. A conjuntiva é uma camada multiepitelial que cobre o lado interno das pálpebras e a parte anterior da esclera. A conjuntiva é caracterizada por menos junções apertadas do que o epitélio da córnea, permitindo melhor permeabilidade de drogas hidrofílicas. No entanto, a vascularização da conjuntiva resulta na absorção sistêmica de uma grande fração das moléculas administradas, novamente limitando muito a biodisponibilidade dos compostos entregues à câmara anterior ^1,2. Uma maneira eficiente de contornar as barreiras externas de permeabilidade ocular é entregar o medicamento diretamente na região de interesse. Por exemplo, a injeção intravítrea é comum para entrega no humor vítreo⁴. Da mesma forma, a injeção intracameral é utilizada para entrega na câmara anterior⁵. O estabelecimento de uma concentração eficiente na câmara anterior é fundamental para várias situações clínicas, como o tratamento da infecção por injeção intracameral de antibióticos e tratamentos anti-inflamatórios pós-operatórios em cirurgias de catarata. Apesar da vantagem da biodisponibilidade aprimorada da substância concedida pela injeção intracameral, existem grandes preocupações de segurança que devem ser consideradas. Por exemplo, a injeção intracameral de drogas pode induzir aumento da pressão intraocular, síndrome tóxica do segmento anterior e síndrome tóxica de destruição de células endoteliais ^5,6. É, portanto, essencial avaliar cuidadosamente em estudos pré-clínicos a eficácia e segurança dos medicamentos administrados por injeções intracamerais para maximizar a eficiência do tratamento e minimizar possíveis efeitos adversos nos pacientes.

Modelos animais experimentais são indispensáveis em estudos pré-clínicos para investigar novos tratamentos. Pequenos roedores, como camundongos e ratos, são os animais de laboratório mais comumente utilizados para tais fins. Esses animais exibem inúmeras semelhanças com a anatomia e fisiologia humanas, fornecendo informações valiosas. Além disso, seu uso é economicamente vantajoso devido ao seu pequeno tamanho, facilidade de manutenção, gestação rápida e capacidade de produzir um grande número de descendentes⁷.

Apesar do uso generalizado de pequenos roedores em modelos de doenças oculares, suas dimensões oculares e anatomia únicas representam desafios significativos durante as manipulações experimentais. Por exemplo, procedimentos como injeções intracamerais, que são relativamente simples em humanos, tornam-se tecnicamente exigentes em camundongos e ratos. Os desafios decorrem de fatores como o pequeno volume de humor aquoso, o cristalino relativamente grande e inflexível, o posicionamento obstrutivo e a curvatura do cristalino dentro dos olhos dos roedores (Figura 1)⁸. Esses desafios aumentam o risco de danos durante injeções intracamerais em roedores, levando a potenciais efeitos adversos e introduzindo variabilidade experimental que pode afetar a validade das conclusões do estudo. Em nossa pesquisa, desenvolvemos com sucesso um procedimento para injeção intracameral segura em ratos. A técnica envolve a criação de um túnel longo, plano e autovedante na córnea para a câmara anterior. Este método não apenas garante precisão, mas também aumenta a reprodutibilidade experimental, abordando os problemas associados às técnicas de injeção em pequenos roedores.

Figura 1: Representação esquemática das características anatômicas do segmento anterior dos olhos de ratos e humanos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

Os experimentos do protocolo foram aprovados pelo Comitê Nacional de Permissão - para ciência animal e cumprem a Declaração ARVO o uso de animais em pesquisas oftalmológicas e visuais. Ratos Sprague-Dawley, fêmeas, com idade entre 8 e 10 semanas, foram utilizados para o presente estudo e foram expostos a ciclos claro-escuro de 12/12 h. Os animais foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Preparação animal

1. Prepare uma mistura anestésica de cetamina (80 mg / kg de peso corporal em 0,8 mL) e xilazina (4 mg / kg de peso corporal em 0,2 mL) e injete-a por via intraperitoneal em uma única injeção para anestesiar os ratos.
2. Injete o analgésico buprenorfina (0,03 mg / kg) por via intraperitoneal em uma única injeção.
3. Aplique anestésico oftálmico tópico oxibuprocaína a 0,4% em ambos os olhos.

2. Criando um túnel de córnea autovedante

1. Estabilize o olho segurando a esclera superior na linha média vertical ao lado da junção corneoescleral com uma pinça oftálmica cirúrgica.
2. Sob um microscópio cirúrgico, coloque uma lâmina estéril de estilete de 0,8 mm, 31 G na região paracentral da córnea na linha média vertical (acima do centro da pupila) em uma posição plana em um ângulo o mais próximo possível da horizontal (Figura 2).
3. Nesta posição, puncione a córnea para fazer uma incisão e criar um túnel longo (2-3 mm) até penetrar na área central da câmara anterior. Evite tocar na lente (Figura 2).
   NOTA: Um túnel bem-sucedido não induzirá vazamento do humor aquoso e superficialidade da câmara anterior.
4. Aplique ofloxacina tópica a 0,3% e dexametasona a 0,1% no olho injetado.
5. Examinar sob microscopia de fenda da seguinte forma.
   1. Observe a profundidade da câmara anterior do olho injetado em comparação com o olho não injetado.
      NOTA: A profundidade deve ser semelhante.
   2. Observe a lente do olho injetado em comparação com o olho não injetado.
      NOTA: A lente deve estar clara. A opacidade pode refletir danos ao cristalino durante o procedimento cirúrgico.

Figura 2: Representação esquemática da lâmina e do ângulo e posição da incisão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Opção 1: Injeção intracameral de azul de tripano para avaliar a injeção bem-sucedida na câmara anterior

1. Carregue 5 μL de azul de tripano em uma seringa Hamilton de vidro estéril de 10 μL com uma agulha romba de 34 G.
   NOTA: A injeção de azul de tripano é descrita como um meio de avaliar o sucesso da injeção durante os estágios de calibração ou configuração do modelo. Nos ambientes experimentais, a seringa pode ser carregada com uma solução do composto de sua escolha.
2. Insira a agulha da seringa carregada através do túnel criado na seção 2 na câmara anterior.
3. Injete e segure a agulha no lugar após a injeção por 2-3 segundos até que todo o fluido desapareça.
4. Remova a agulha puxando-a suavemente e lentamente para evitar vazamento do túnel da córnea.
5. Examinar sob microscopia de fenda. Avalie a profundidade da câmara anterior para excluir rasos e verifique a presença de azul de tripano na câmara anterior.
6. Repita o exame de fenda após 24 h, 48 h e 72 h.

4. Opção 2: injeção intracameral de Hoechst para avaliar a biodisponibilidade do material injetado na camada de células endoteliais

1. Coloque 5 μL de Hoechst em uma seringa Hamilton de vidro estéril de 10 μL com uma agulha romba de 34 G.
   NOTA: A injeção de Hoechst é descrita como um meio de avaliar a biodisponibilidade do material injetado por absorção na camada de células endoteliais e é útil durante os estágios de calibração ou configuração do modelo. Nos ambientes experimentais, a seringa pode ser carregada com uma solução do composto de sua escolha.
2. Insira a agulha da seringa carregada através do túnel criado na seção 2 na câmara anterior.
3. Injete e segure a agulha no lugar após a injeção por 2-3 segundos até que todo o fluido desapareça.
4. Remova a agulha puxando-a suave e lentamente para evitar vazamento da incisão do túnel da córnea.
5. Aproximadamente 15-20 min após a injeção, eutanasiar os ratos por injeção intraperitoneal de 500 mg / kg de pentobarbital sódico.
6. Enuclear ambos os olhos e isolar as córneas. Colete a córnea não injetada como controle.
7. Pinte ambas as córneas com vermelho de alizarina S a 0,5% de acordo com as instruções do fabricante para identificar as células endoteliais.
8. Examine ao microscópio óptico para obter imagens da coloração com vermelho de alizarina das células endoteliais e ao microscópio fluorescente para observar a coloração de Hoechst, em comparação com a córnea não injetada como controle.

Resultados

Ratos Sprague Dawley foram injetados intracameralmente com 5 μL de azul de tripano, de acordo com o protocolo descrito acima. O exame com lâmpada de fenda imediatamente após a injeção demonstrou que a câmara estava corada com azul de tripano, indicando que o material injetado atingiu a câmara anterior (Figura 3). Além disso, a profundidade da câmara anterior estava intacta, sugerindo que a injeção não causou vazamento de humor aquoso e superficia...

Discussão

Os modelos de pesquisa pré-clínica devem fornecer um ambiente controlado e reprodutível para garantir a confiabilidade e aplicabilidade dos achados. Na pesquisa oftalmológica, os modelos de injeção ocular são comumente usados em diversos aspectos de pesquisa, desde o estabelecimento de modelos de doenças, testes de novos tratamentos e avaliação de reações teciduais e potenciais efeitos adversos.

As injeções intracamerais servem como uma técnica ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin Red	Alpha Aesar	042040.5
Buprenorphine	Richter pharma	102047
Dexamethasone 0.1%	Fisher Pharmaceutical	393102-0413
Hamilton glass syringe 10 μL	Hamilton Co.	721711
Hoeschst	Merck	B2261
Ketamine	Bremer pharma GMBH (medimarket)	17889
Ofloxacin 0.3% eye drops	Allergan	E92170
Oxybuprocaine Hydrochloride 0.4%	Fisher Pharmaceutical	N/A
Pentobarbital sodium 200 mg/mL	CTS	N/A
Slit microscope	Haag-streit bern	b-90019115
Sprague-Dawley Rats	Envigo	N/A
Stiletto blade 31 G 0.8 mm	Tecfen medical (skymed)	QKN2808
Surgical microscope	Zeiss	OPMI-6 CFC
Trypan Blue	Sartorius	03-102-1B
Xylazine	Eurovet Animal Health	615648