פרוטוקול זה מדגים ביצוע בדיקת מולקולה בודדת להדמיה חיה של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG. הוא מתאר (1) הכנת מצע דנ"א, (2) טיהור פלואורסצנטי המסומן כמנחת מסוקים Drosophila melanogaster CMG, (3) הכנת תא זרימה מיקרופלואידי למיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF), ו-(4) בדיקת שחרור DNA של מולקולה יחידה.
שכפול גנום נאמן חיוני לשימור היציבות הגנטית של תאים מתחלקים. שכפול DNA מתבצע בשלב S על ידי קומפלקס דינמי של חלבונים המכונה רפליזום. בלב הרפליזום נמצא הליקז CDC45-MCM2-7-GINS (CMG), המפריד בין שני הגדילים של הסליל הכפול של הדנ"א כך שפולימראז DNA יכול להעתיק כל גדיל. במהלך שכפול הגנום, על הרפליזומים להתגבר על שפע של מכשולים ואתגרים. כל אחד מאלה מאיים על יציבות הגנום, שכן כישלון לשכפל דנ"א באופן מלא ומדויק עלול להוביל למוטציות, מחלות או מוות תאי. לכן, יש עניין רב להבין כיצד CMG מתפקד ברפליזום הן במהלך שכפול נורמלי והן במהלך לחץ שכפול. במאמר זה אנו מתארים בדיקת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF) באמצעות חלבונים מטוהרים רקומביננטיים, המאפשרת הדמיה בזמן אמת של מולקולות DNA מתוחות הקשורות לפני השטח על ידי קומפלקסים CMG בודדים. בדיקה זו מספקת פלטפורמה רבת עוצמה לחקר התנהגות CMG ברמת המולקולה היחידה, ומאפשרת לצפות ישירות בדינמיקת מנחת המסוקים עם שליטה בזמן אמת על תנאי התגובה.
שכפול הדנ"א מוסדר היטב, מכיוון שתא חייב לשכפל את הגנום שלו באופן מדויק כדי למנוע מוטציות, מחלות או מוות. שכפול הדנ"א האיקריוטי מתבצע על ידי קומפלקס הרפליזום, אשר משחרר את הדנ"א ההורי ומשתמש בדנ"א חד-גדילי (ssDNA) כתבנית לסנתז דנ"א חדש אליו. בשלב G1, הקסמרים כפולים לא פעילים קטליטית של MCM2-7 נטענים על דנ"א דו-גדילי (dsDNA) במקורות שכפול1. בשלב S, קומפלקסים MCM2-7 מופעלים על ידי קשירה של CDC45 ו- GINS2 ליצירת קומפלקסים CMG של 11 תת-יחידות (CDC45, MCM2-7, GINS). כל CMG יוזם שחרור DNA בכיוונים מנוגדים, ויוצר את יחידת הליבה שהרפליזום מסדר את עצמו סביב3.
לפני שני עשורים זוהה לראשונה מנחת המסוקים CMG כקומפלקס בן 11 תת-יחידות, החיוני לשכפול DNA4. מאז, ההבנה שלנו של CMG התקדמה במידה ניכרת, מטעינה והפעלה 5,6, לשחרור DNA וסיום7. טכניקות ביוכימיות וביולוגיות מבניות מסורתיות היו קריטיות לרבות מהתגליות הללו; עם זאת, שיטות אלה היו לעתים קרובות מוגבלות ביכולתן לחקור את ההיבטים הדינמיים יותר של CMG. שיטות של מולקולה בודדת משתמשות במניפולציה פיזיקלית של ביומולקולות בודדות כדי למדוד או לדמיין את פעילותן מולקולה אחת בכל פעם. זה יכול לשמש כדי לספק תובנה לגבי הדינמיקה בזמן אמת של חלבונים כי הם לעתים קרובות החמיץ או בלתי ניתן לגילוי על ידי טכניקות אחרות 8,9.
במאמר זה אנו מתארים בדיקה כוללת של מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית (TIRF) כדי להמחיש את שחרור הדנ"א על ידי מנחת מסוקים CMG בזמן אמת. CMG מטוהר ומסומן באופן פלואורסצנטי נטען על הקצה החופשי של 3 אינץ' של DNA ארוך המכיל מבנה מזלג DNA מוכן מראש. דנ"א ליניארי נמתח על גבי כיסוי ביוטין-PEG בתא זרימה מיקרופלואידי על ידי קשירת כל קצה של הדנ"א ברצף לפני השטח. גישה זו מאפשרת קשירת DNA אחידה יותר, אשר מפחיתה באופן משמעותי את השונות שיש לקחת בחשבון במהלך ניתוח הנתונים. בנוכחות ATP-γ-s, CMG נטען על הדנ"א החד-גדילי בקצה 3' של המזלג. ATP-γ-s הוא אנלוגי ATP הניתן להידרוליזה איטית, המאפשר ל-CMG להיקשר לדנ"א אך לא להשתחרר. הוספה מאוחרת יותר של ATP, יחד עם RPA מטוהר ומתויג פלואורסצנטית, מפעילה CMG ומתחילה שחרור DNA נרחב. מבחינה ויזואלית, CMG עובר טרנסלוקציה לאורך הדנ"א, ומשאיר אחריו מערכת הולכת וגדלה של ssDNA הקשור ל-RPA. קצה הדנ"א הבלתי קשור נע עם CMG, ויוצר "כדור הדוק" עקב דחיסה הנגרמת על ידי קשירת RPA. תכנון תא הזרימה מאפשר להחליף את החיץ בכל נקודה במהלך השחרור, מה שמעניק שליטה רבה במהלך כל ניסוי ומעליו.
פרוטוקול זה מחולק לארבע שיטות, אשר ניתן לבצע בנפרד אחד מהשני. סעיף 1 מתאר את הכנת מצע DNA ליניארי מפוצל של 20 קילו-בתים לבדיקות של מולקולה בודדת. סעיף 2 מתאר את הטיהור והתיוג הפלואורסצנטי של Drosophila melanogaster CMG (DmCMG). מידע מרכזי על הביטוי של DmCMG כלול בסעיף ההערות. סעיף 3 מכסה את הכנת תא זרימה מיקרופלואידי שניתן להשתמש בו במיקרוסקופ TIRF. סעיף 4 מתאר כיצד לבצע את בדיקת שחרור הדנ"א של מולקולה בודדת.
1. הכנת דנ"א ליניארי מפוצל של 20 קילובייט המשמש בבדיקות של מולקולות בודדות (איור 1)
איור 1: ייצוג גרפי של הכנת מצע דנ"א. (A) קצה מזלג הדנ"א הביוטינילי נוצר על-ידי חישול שני אוליגונוקלאוטידים משלימים חלקית: ביוטינילציה ולא ביוטינילציה. (B) מקטע dsDNA הראשי (~20 kb) נוצר על ידי תקציר הגבלה של פלסמיד pGC261 עם שני אנזימים ליצירת דנ"א ליניארי עם שלוחות שונות בכל קצה. (C) קצה הדנ"א הדו-צדדי של דיגוקסיגנין מתקבל על ידי תגובת PCR המבוצעת בנוכחות digoxigenin-dUTP, ואחריה תקציר הגבלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
2. טיהור של Drosophila melanogaster CMG (איור 2)
איור 2: טיהור של Drosophila melanogaster CMG מ-4 ליטר של תאי Hi Five. החלבונים נפתרו על 4%-12% ג'ל פוליאקרילאמיד Bis-Tris מתחת ל-200 וולט בנוכחות חיץ MOPS. הדגימה מוצגת בכל שלב של הטיהור (תא ליזט - 2 μL, FLAG elution - 10 μL, לאחר עמודת חילופי היונים הראשונה - 10 μL, ולאחר התיוג ועמודת חילופי היונים השנייה - 1 μL. (A) צביעת קומאסי מאשרת את נוכחותן של כל 11 יחידות המשנה של קומפלקס CMG לפני (10 μL), ואחרי (1 μL) תיוג פלואורסצנטי. (B) יעילות ההתוויה של תת-היחידה MCM3 אומתה על-ידי סריקה עבור Cy5 עם מנתח תמונות פלואורסצנטי באמצעות מסנן אדום בעל מעבר ארוך (LPR). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
הערה: כדי להכין את Drosophila melanogaster CMG המסומן באופן פלואורסצנטי, הוכנס אתר מחשוף TEV (ENLYFQG) ואחריו ארבע שאריות Gly במורד הזרם של תג FLAG N-terminal בתת-היחידה MCM3 (בווקטור pFastBac1)10. כדי לבטא את המתחם, נעשה שימוש במערכת הביטוי baculovirus. עבור טרנספקציה ראשונית, תאי Sf21 שימשו בנפרד עבור כל תת-יחידה CMG (שלב וירוס P1). כדי להגביר עוד יותר את הנגיפים, נעשה שימוש בתאי Sf9 (שלב וירוס P2). לאחר מכן, תרביות תאי Sf9 (100 מ"ל לכל תת-יחידה CMG; 0.5 x 106 תאים / מ"ל) היו נגועות בנגיף P2 0.5 מ"ל בתוספת 10% נסיוב עגל עובר (שלב וירוס P3). כדי לבטא את כל קומפלקס CMG ב 4 L של Hi חמישה תאים (1 x 106 תאים / מ"ל), 200 מ"ל של וירוסים P3 שימשו עבור כל אחת מתתי היחידות. לאחר קצירת תאי Hi Five המבטאים את קומפלקס CMG, ניתן להקפיא את גלולת התא בחנקן נוזלי ולאחסן אותה בטמפרטורה של -80°C. בצע את הטיהור כולו על קרח או ב 4 °C (75 °F). ניתן להכין את המאגרים מראש, בתנאי שמוסיפים את החומרים המחזרים (DTT או 2-Mercaptoethanol) ומעכבי פרוטאז (CAUTION) ממש לפני השימוש. ודא שכל המאגרים מקוררים מראש, מסוננים ומנוטרלים גזים.
3. הכנת תא הזרימה (איור 3)
איור 3: ייצוג גרפי של הכנת תא הזרימה. (A) גזרו סרט דו-צדדי כך שיתאים לגודל חתיכת הזכוכית. ישר את השקופית על גבי הסרט וסמן את המיקום של כל חור עם מחט. בעזרת סכין גילוח, חתכו סביב כל אחיזה ליצירת ערוץ. (B) מקלפים צד אחד של הסרט ומדביקים את הסרט על חתיכת הזכוכית. ודא ששני החורים נמצאים בתוך התעלה. מקלפים את הקצה השני של הסרט ומדביקים את כיסוי הביוטין-PEG מלמעלה. (C) הכניסו את צינור הפוליאתילן לכל חור ואטמו את הצינורית במקומה עם אפוקסי, ואטמו כל פיסת זכוכית גם לכיסוי. (D) לאחר השימוש בשני הערוצים, משכו את הצינור והכניסו את תא הזרימה לצנצנת מכתימה מלאה באצטון. לאחר כ-24 שעות, האפוקסי והסרט יתרככו, וניתן יהיה לקלף את שכבות תא הזרימה. ניתן לשחזר את חתיכות הזכוכית ולאחסן אותן באצטון לשימוש חוזר ללא הגבלת זמן ליצירת תא הזרימה הבא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
4. בדיקת TIRF של מולקולה בודדת כדי להמחיש שחרור DNA בתיווך CMG
איור 4: דנ"א שנקשר לפני השטח. (A) כאשר קושרים מצעי דנ"א עם ביוטין בשני הקצוות, המרחק בין שני הקשרים יכול להשתנות בהתאם לאופן שבו הקצוות באים במגע עם פני השטח (i). על ידי שימוש בדיגוקסיגנין בקצה אחד, ניתן להפריד באופן זמני את הקשירה של כל קצה לקבלת מרחקי קשירה עקביים יותר ודנ"א נמתח באופן אחיד יותר (ii). (B) שדה ראייה לדוגמה המראה דנ"א קשור בשני קצותיו (מסומן בתווית דיגוקסיגנין) ומוכתם בכתם פלואורסצנטי של חומצת גרעין. דנ"א, הקשור בשני קצותיו, מופיע כקו, ואילו דנ"א הקשור בקצה אחד בלבד מופיע ככתמים. באופן אידיאלי, הדנ"א צריך להיות קשור בצפיפות ככל האפשר מבלי לחפוף דנ"א אחר. התמונה היא 512 x 512 פיקסלים (גודל פיקסל = 154.6 nm). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
כאשר CMG משחרר דנ"א, מערכת RPA אופיינית תגדל עם הזמן (איור 5). קצה ה-5' של הדנ"א הלא פצוע קשור לפני השטח; לפיכך, הוא נראה כקטע ליניארי של אות RPA בין הקשירה למזלג. קצה 3' אינו קשור, ולכן נע עם המזלג ונצפה כאות EGFP-RPA קומפקטי. המיקום של גדיל טרנסלוקציה דחוס unwound מתאים בערך למיקום של מזלג השכפול, אשר נע יחד עם LD655-CMG דמיינו באמצעות לייזר 640 ננומטר.
חשוב למזער את הנזק למצע הדנ"א, מאחר שנזק כמו ניקים חד-גדיליים של דנ"א מפחית את מספר האירועים הנצפים, ומגביל את כמות הנתונים שניתן לאסוף (איור 6).
איור 5: בדיקת שחרור דנ"א של מולקולה יחידה. מצע הדנ"א קשור למשטח כיסוי. CMG מטוהר המסומן ב-LD655 מודגר עם הדנ"א במשך 15 דקות ב-ATP-g-s. ATP ו-RPA מטוהר המסומן בתווית EGFP מתווספים, ומתחילים שחרור DNA נרחב על ידי CMG. סכימת קריקטורה (משמאל) וקימוגרף של נתונים מייצגים (מימין) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: נזק לדנ"א מפחית את תפוקת הבדיקה. (A) CMG לא יכול לשחרר דנ"א מעבר להפסקה בעמוד השדרה של הדנ"א (DNA nick). ניק בתבנית הגדיל המוביל גורם ל-CMG להחליק מהדנ"א, וגם תבנית CMG וגם תבנית הגדיל המוביל אובדות. ניק בתבנית הגדיל המפגר גורם לתבנית הגדיל המפגר להיפרד משאר הדנ"א, וכל פיסת דנ"א נסוגה לקשירה המתאימה לה. הדבר מומחש על-ידי (i) סכמות מצוירות ו-(ii) קימוגרפיות של אירועים אלה (ii). נתונים מייצגים עם (B) מצע DNA פגום באופן מינימלי לעומת (C) מצע DNA פגום יותר ב- (i) 5 דקות, (ii) 15 דקות ו- (iii) 60 דקות בשדה ראייה יחיד. מצע הדנ"א הפגוע יותר אינו מייצר רצועות ארוכות של השתחררות, מכיוון שה-CMGs נתקלים בניקים בשלב מוקדם יותר, למרות רמות דומות של פעילות שחרור (צפיפות דומה של כתמי RPA גדלים ב-5 דקות, מה שמצביע על יעילות העמסה/שחרור CMG דומה). שדה הראייה הוא 512 x 512 פיקסלים (גודל פיקסל = 154.6 nm). 1% עוצמת לייזר (488 ננומטר) הדמיה EGFP-RPA. סרגל קנה מידה המציג 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
בדיקה זו מספקת פלטפורמה להתבונן ולחקור את הדינמיקה בזמן אמת של CMGs בודדים, הן בבידוד והן בהקשר של הגורמים הנוספים הרצויים. עם זאת, כמו בטכניקות פלואורסצנטיות רבות של מולקולה בודדת, ישנם כמה אתגרים נפוצים שיכולים לדרוש אופטימיזציה כדי להתגבר עליהם. אלה מתייחסים בדרך כלל לדימות פלואורופורים לאורך תקופות זמן ארוכות (הלבנה, בהירות), הכנת מצע DNA (נזק לדנ"א), איכות פני התא הזורמים (רעשי רקע, אינטראקציות לא ספציפיות), או איכות הכנת החלבון המטוהר (זיהום נוקלאז, יעילות התוויה).
כל פלואורופור משתנה ביציבות האור ובבהירותו, ולכן חשוב לבחור מולקולה מתאימה. כאשר הדמיה של חלבונים אוליגומריים המסומנים באופן פלואורסצנטי, כמו RPA, ניתן להשתמש בעוצמת לייזר נמוכה יותר מכיוון שפלואורופורים רבים יתעוררו בסמיכות, וייצרו אות נראה. עבור הדמיה של פלואורופורים בודדים, לדוגמה, CMG המסומן על תת-יחידה יחידה, יש צורך בעוצמת לייזר גבוהה יותר כדי לצפות בפלואורופור בבירור. ניתן להאריך את חיי הפלואורופור על ידי מזעור החשיפה ללייזר, למשל על ידי הפחתת התדירות שבה התמונות מצולמות. נוסף על כך, פלואורופור מעורר מייצר מיני חמצן תגובתי (ROS), אשר יכול לתרום להלבנה פוטו. הכללת מערכת חיטוי חמצן במאגר ההדמיה יכולה להאריך את חיי הפלואורופורים על ידי ביטול ROS. עם זאת, כמה מערכות חיטוי חמצן יכול להשפיע על pH12.
לגבי הכנת מצע DNA, חיוני למזער את הנזק לדנ"א, כגון ניקים או רווחים חד-גדיליים. נזק מוגזם מונע שחרור נרחב של הדנ"א, ומגביל את כמות הנתונים שניתן לאסוף. נזק יכול לנבוע מגזירה מכנית, חימום מוגזם, כתוצאה מזיהום נוקלאז, או ROS שנוצר במהלך ההדמיה. ניתן למזער את הגזירה על ידי טיפול זהיר בדגימת הדנ"א על ידי שימוש בקצוות רחבים לפיפט, פיפטינג איטי והימנעות מהזזת הדגימה. ניתן למזער את ההשפעה של ROS על ידי הפחתת החשיפה ללייזר או הכללת מערכת ניקוי חמצן במאגר ההדמיה. לאחר הכנת מצע הדנ"א, ניתן להשתמש בערכות תיקון DNA מסחריות כדי לתקן את הנזק לפני ביצוע תגובה משחררת.
יעילות שחרור הדנ"א תלויה גם בטוהר ובפעילות של CMG. מומלץ להעריך את טוהר הדגימה לאחר כל שלב טיהור על ידי אלקטרופורזה SDS-PAGE כדי לקבוע היכן יש צורך באופטימיזציה. אם נצפים יותר מדי מזהמים לאחר השלב הסופי, זה עשוי לעזור לשנות את נפחי שיפוע המלח המשמשים לפליטה מעמודת CaptoHiRes Q (5/50). כמו כן, חשוב מאוד להסיר כל עודף פפטיד פלואורסצנטי המשמש לסימון החלבון, מכיוון שהוא יכול ליצור רקע לא רצוי על משטח הכיסוי. זה גם חיוני כדי למנוע זיהום נוקלז, כמו זה יכול להשפיל את מצע ה- DNA. לאחר ניסוי, צביעת הדנ"א שנותר בתפוז SYTOX יכולה להיות דרך טובה לבדוק אם הדנ"א פורק באופן משמעותי או לא. רמה מסוימת של נזק לדנ"א היא בלתי נמנעת במהלך ניסוי, אך נזק משמעותי מצביע לעתים קרובות על זיהום נוקלאז בעייתי.
הבדיקה מוגבלת מטבעה גם על ידי הרזולוציה של כתמים מוגבלים בעקיפה, מה שמחייב חלבונים פלואורסצנטיים להיות במרחק של מאות זוגות בסיסים (אם לא יותר) כדי להבדיל ביניהם כנפרדים. זה מגביל את הפרטים שבהם התקדמות CMG ואינטראקציות ניתן לצפות.
מספר האירועים שאנו צופים בהם עבור כל ניתוח משתנה. עבור ניסוי מוצלח, אנו מצפים לראות לפחות כמה קטעי RPA באורך מספיק לכל שדה ראייה 512x512 פיקסלים (גודל פיקסל = 154.6 ננומטר). ניתן לצלם שדות ראייה מרובים באותו ניסוי, מה שמאפשר איסוף נתונים נוסף בעת הצורך. האסופות לא צריכות להיות באותו אורך ולא להגיע לסוף הדנ"א כדי להיות שימושיות. לדוגמה, ניתן לקבוע את מרחק הקשירה הממוצע עבור כל ניסוי על ידי מדידת אורך הדנ"א המוכתם ב-SYTOX לפני הוספת CMG. זה יכול לשמש כדי להעריך כמה דנ"א כבר unwound עבור כל מערכת RPA (כל עוד מספיק DNA הוא unwound כדי להזיז את המזלג באופן גלוי) על ידי המרת המרחק מ "μm נסע" ל "kb unwound".
CMG מפגין פעילות משחררת על מגוון מצעי DNA, אך חיוני לספק קצה DNA חופשי של 3' על דש polyT של לפחות 30 nt כדי להכיל את טביעת הרגל של CMG10. הכללת מוטות ביוטין מרובים במזלג מבטיחה קשירה חזקה של פני השטח. שאר מצע הדנ"א יכול להיות מתוכנן מחדש במגוון דרכים, כגון לכלול רצפי דנ"א שונים, אורכים ושינויים כימיים. הקונפורמציה של ה- DNA יכולה להשתנות באמצעות ריכוזים שונים של מגנזיום אצטט. בריכוזים גבוהים יותר (≥10 מילימול) של מגנזיום אצטט, חוט הלהט ssDNA מצופה RPA נדחס, מה שמוביל למשיכת הדנ"א הנלמדת על ידי קשירת RPA במהלך הרפיה. זה יכול להיות שימושי מכיוון שהוא מונע מהדנ"א לנוע יתר על המידה, ומאפשר למדוד בצורה מדויקת יותר את המיקום של CMG ושל התקדמות משחררת. בריכוזים נמוכים (~ 3 mM) של מגנזיום אצטט, RPA-ssDNA נשאר רגוע לאורך כל הדרך.
הבדיקה המתוארת של מולקולה בודדת מייצגת פלטפורמה שניתן לבנות עליה ולשנות אותה כדי לחקור היבטים נוספים של שכפול DNA. במהלך שכפול הדנ"א, CMG פועל כליבה שהרפליזום ומרכיביו מתאספים סביבה. לכן, ניתן להוסיף חלבונים מטוהרים נוספים לבדיקה זו, כולל גורמים נלווים כמו TIMELESS, TIPIN, ו- CLASPIN, כדי לחקור את השפעתם על דינמיקת CMG. חלבונים אלה הוכחו כמשפיעים על קצב השכפול של מזלגות13, אך לא ברור כיצד הם משפיעים על קצב שחרור CMG. לכן, יהיה מעניין לחקור כיצד חלבונים שונים משפיעים על CMG באמצעות בדיקה זו. תוספת של DNA פולימראז עשויה לתת תובנה טובה יותר לגבי שכפול דנ"א מעבר לשחרור הדנ"א בלבד, כפי שתואר קודם לכן עם חלבוני שמרים14. יתר על כן, טיהור של CMG שונה עשוי לספק הבנה טובה יותר של האופן שבו מוטציות מסוימות או שינויים לאחר תרגום משפיעים על פעילות הליקז15,16. בנוסף, תכנון מצעי דנ"א שונים יכול לאפשר לדנ"א להתפרק על ידי CMG במגוון תנאים המחקים את עקה השכפול17. שינויים אלה כוללים מכשולי דנ"א 9,18, קישורים צולבים בין-גדיליים 19,20,2 1, ואי-רציפות בגדילי הדנ"א22.
למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי אינטרסים אחרים.
אנו מודים לגאורגה צ'יסטול על אספקת פלסמיד pGC261 ולמתקן לביולוגיה כימית של מכון פרנסיס קריק לסינתזה ותיוג פפטידים. עבודה זו מומנה על ידי מכון פרנסיס קריק, המקבל מימון ליבה מ- Cancer Research UK, המועצה הבריטית למחקר רפואי ו- Wellcome Trust (CC2133).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | |
Acrylamide / Bis Solution 40% | BioRad | 1610148 | |
Agarose UltraPure | Invitrogen | 16500-500 | Used to prepare Tris Buffer (pH 8) |
ÄKTA Pure | GE Healthcare | - | Used with Fraction Collector F9-C; protein purification system |
ANTI-FLAG M2 affinity gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
APS 10% | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
ATP (200 mM) | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
ATP-g-s (100 mM) | Sigma-Aldrich | 11162306001 | |
Biotin-PEG coverslip | N/A | N/A | Prepared as described: https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2012.03.033 |
Biotinylated anti-digoxigenin antibody | Perkin Elmer | N/A | |
Blu Tack | Bostik | N/A | Adhesive putty |
Boric acid | Thermo Fisher Scientific | B/3800/53 | |
BSA; 33 mg/mL | SIGMA-ALDRICH | A3858-10G | Diluted from the stock |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
CaptoHiRes Q (5/50) | Cytiva | 29275878 | Connected to the AKTA protein purification system; high-resolution ion exchange chromatography column |
Casein (5% in water, 50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | C4765-10ML | |
ChemiDoc system | Bio-Rad | N/A | |
Clips | N/A | N/A | |
Cutting board | N/A | N/A | |
Dialysis tubing (3.5 kDa) | Fisher Scientific | 11425859 | |
digoxigenin-11-dUTP | Roche | 11209256910 | |
DNA loading dye 6x | NEB | B7024S | |
dNTP 10 mM | NEB | N0447S | |
Double-sided tape (0.14 mm thick) | N/A | N/A | |
DTT | Fluorochem Limited | M02712-10G | |
DYKDDDDK peptide | N/A | N/A | Synthetised by chemical biology STP of The Francis Crick Institute |
EDTA | Thermo Fisher Scientific | D/0700/68 | |
EGFP-RPA | N/A | N/A | Purified as desribed in ‘Single Molecule Analysis’, Series Methods in Molecular Biology, Vol. 783 (2011), Peterman, E. J. G. and Wuite G. J. L. editors, Humana Press. Protein information: 2 mM, human, expressed in E. coli. |
EGTA | Sigma-Aldrich | 03779-10G | |
Epoxy - 5 minute | Devcon | 20845 | |
Fujifilm FLA-5000 | Fujifilm | FLA-5000 | Fluorescent image analyzer |
GelRed Nucleic Acid Stain; 10000x | Cambridge Bioscience | 41003-BT | Example of nucleic acid stain which is a safer alternative to ethidium bromide. |
Glass or quartz slide with holes for tubing | Dremel Model 395 | 1 mm thick slide, cut to 2.4 cm x 1cm, two holes drilled 1.4 mm apart. The holes should be drilled to different sizes to accommodate different tubing at each end. | |
Glycerol | Fisher Scientific | G/0650/17 | |
Glycine HCl, pH 3.5 | Sigma-Aldrich | G8898 | |
Hamilton syringe, 1000 series GASTIGHT, PTFE luer lock 1010TLL, PTFE Luer lock (with slots), volume 10 mL | Merck | 26211-U | |
HEPES pH 7.5 | Sigma-Aldrich | H4034 | |
I-CeuI | NEB | R0699L | |
KCl | Fisher Scientific | P/4280/53 | |
Magnesium acetate | Sigma-Aldrich | M2545 | |
Maxi GeBaFlex-tube Dialysis Kit; MWCO 14 kDa | Generon | D055 | |
Metal spatula | N/A | N/A | |
Metal tweezers | N/A | N/A | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
Millex-GP (Syringe filters) 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Needle | N/A | N/A | |
NotI-HF | NEB | R3189L | |
NuPAGE 4%–12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | 10247002; | |
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific | NP0001 | |
Objective heater | Okolab | N/A | |
PCR mix - 2x | Prepared from Phusion DNA polymerase (20 µL), 10 mM dNTPs (40 µL), 5x Phusion HF buffer (400 µL) and water (540 µL). | ||
Peptide NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH, labelled with LD655-MAL | N/A | N/A | peptide NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH, labeled with LD655-MAL (Lumidyne Technologies) on the cysteine residue, was synthetised and purified by the peptide chemistry STP of The Francis Crick Institute |
pGC261 plasmid | N/A | N/A | https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.10.053 |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
Plastic tweezers | N/A | N/A | |
Polyethylene tubing PE20 (inner diameter 0.015”, outer diameter 0.043”) | Becton Dickinson | 427406 | |
Polyethylene tubing PE60 (inner diameter 0.03”, outer diameter 0.048”) | Becton Dickinson | 427416 | |
Poly-Prep Chromatography Columns; 10 ml and 20 ml | Bio-Rad | 7311550 | |
Potassium Glutamate (L-glutamic acid potassium salt monohydrate) | Sigma | G1501-1KG | |
Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA free) | Roche | 5056489001 | |
Pump 11 Elite Infusion/Withdrawal Programmable Single Syringe | Harvard Apparatus | 70-4504 | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
Razor blade | VWR International Ltd | 233-0156 | |
rCutSmart Buffer; 10x | NEB | B6004S | |
Sodium acetate | Thermo Fisher Scientific | S/2120/53 | |
Sortase (pentamutant) | N/A | N/A | Purified based on: https://doi.org/10.1073/pnas.1101046108 |
Spin-X Centrifuge Tube Filters; 0.22 µm cellulose acetate | Fisher Scientific | 10310361 | |
Sterile scalpel | N/A | N/A | |
Steritop Vacuum Driven Disposable Filtration System; 0.22 um; PES; | Millipore | S2GPT05RE | |
Streptavidin (1 mg/mL) in 1x PBS buffer | Sigma | S4762-10MG | 20 µL aliquotes |
SYBR Gold | Thermo Fisher Scientific | S11494 | Highly sensitive nucleic acid stain we used to visualise DNA fork substrate. |
SYTOX orange; 5 µM in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
T4 DNA ligase | NEB | M0202M | |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
TEMED | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | |
TEV protease (1 mg/mL); EZCut | Biovision | 7847-10000 | |
Tissue grinders, Dounce type (40 mL, Wheaton) | DWK Life Sciences | 432-1273 | |
Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | Used to prepare Tris Buffer (pH 8) |
Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Tween-20 | Promega UK Ltd | H5152 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved