Этот протокол демонстрирует выполнение анализа одной молекулы для визуализации раскручивания ДНК с помощью хеликазы CMG в реальном времени. В ней описывается (1) получение субстрата ДНК, (2) очистка флуоресцентно меченой геликазы Drosophila melanogaster CMG, (3) подготовка микрофлюидной проточной ячейки для микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF) и (4) анализ раскручивания одномолекулярной ДНК.
Точная дупликация генома имеет важное значение для сохранения генетической стабильности делящихся клеток. Репликация ДНК осуществляется во время S-фазы динамическим комплексом белков, называемым реплисомой. В основе репликазы лежит геликаза CDC45-MCM2-7-GINS (CMG), которая разделяет две нити двойной спирали ДНК таким образом, что ДНК-полимеразы могут копировать каждую цепь. Во время дупликации генома реплисомы должны преодолеть множество препятствий и проблем. Каждый из этих факторов угрожает стабильности генома, так как неспособность полностью и точно воспроизвести ДНК может привести к мутациям, заболеваниям или гибели клеток. Поэтому очень интересно понять, как CMG функционирует в репликсоме как при нормальной репликации, так и при репликационном стрессе. В данной работе мы описываем микроскопию полного внутреннего отражения (TIRF) с использованием рекомбинантных очищенных белков, которая позволяет в режиме реального времени визуализировать поверхностно привязанные растянутые молекулы ДНК отдельными комплексами CMG. Этот анализ обеспечивает мощную платформу для исследования поведения CMG на уровне отдельных молекул, позволяя напрямую наблюдать динамику геликаза с контролем условий реакции в режиме реального времени.
Репликация ДНК строго регулируется, так как клетка должна точно дублировать свой геном, чтобы предотвратить мутации, болезни или смерть. Репликация эукариотической ДНК осуществляется с помощью комплекса репликосом, который раскручивает родительскую ДНК и использует одноцепочечную ДНК (одноцепочечную ДНК) в качестве матрицы для синтеза новой ДНК. В фазе G1 каталитически неактивные двойные гексамеры MCM2-7 загружаются на двухцепочечную ДНК (дцДНК) в начале репликации1. В S-фазе комплексы MCM2-7 активируются путем связывания CDC45 иGINS2 с образованием 11-субъединичных комплексов CMG (CDC45, MCM2-7, GINS). Каждый CMG инициирует раскручивание ДНК в противоположных направлениях, образуя ядро, вокруг которого репсисома располагается вокруг3.
Два десятилетия назад геликаза CMG была впервые идентифицирована как комплекс из 11 субъединиц, необходимый для репликации ДНК4. С тех пор наше понимание CMG значительно продвинулось вперед, от загрузки и активации 5,6 до раскручивания и завершения ДНК7. Традиционные методы биохимической и структурной биологии сыграли решающую роль во многих из этих открытий; однако эти методы часто были ограничены в своих возможностях изучения более динамичных аспектов CMG. Методы с использованием одной молекулы используют физические манипуляции с отдельными биомолекулами для измерения или визуализации их активности по одной молекуле за раз. Это может быть использовано для получения представления о динамике белков в реальном времени, которые часто пропускаются или не обнаруживаются с помощью других методов 8,9.
В этой статье мы описываем микроскопию полного внутреннего отражения (TIRF) для визуализации раскручивания ДНК хеликазой CMG в режиме реального времени. Очищенный, флуоресцентно меченный CMG загружается на свободный 3'-конец длинной ДНК, содержащей предварительно созданную структуру ДНК-вилки. Линейная ДНК растягивается на покровном стекле биотин-ПЭГ в микрофлюидной проточной ячейке путем последовательного привязывания каждого конца ДНК к поверхности. Такой подход позволяет обеспечить более равномерное связывание ДНК, что значительно снижает вариации, которые необходимо учитывать при анализе данных. В присутствии АТФ-γ-ов, CMG загружается на одноцепочечную ДНК на 3'-конце вилки. АТФ-γ-s является медленно гидролизуемым аналогом АТФ, который позволяет ЦМГ связываться с ДНК, но не раскручиваться. Последующее добавление АТФ, наряду с очищенной, флуоресцентно меченной РПА, активирует CMG и инициирует обширное раскручивание ДНК. Визуально CMG перемещается вдоль ДНК, оставляя за собой растущий участок RPA-связанной одноцепочной ДНК. Несвязанный конец ДНК перемещается с CMG, образуя «плотный шар» из-за уплотнения, вызванного связыванием RPA. Конструкция проточной ячейки позволяет заменять буфер в любой момент во время размотки, обеспечивая отличный контроль во время и во время каждого эксперимента.
Этот протокол разделен на четыре метода, которые могут выполняться независимо друг от друга. В разделе 1 описывается приготовление 20-килобайтного линейного разветвленного субстрата ДНК для одномолекулярных анализов. В разделе 2 описывается очистка и флуоресцентное мечение Drosophila melanogaster CMG (DmCMG). Ключевая информация о выражении DmCMG включена в раздел примечаний. Раздел 3 посвящен подготовке микрофлюидной проточной ячейки, которую можно использовать на микроскопе TIRF. В разделе 4 описано, как провести анализ раскручивания одномолекулярной ДНК.
1. Получение линейной разветвленной ДНК размером 20 кб, используемой в одномолекулярных анализах (Рисунок 1)
Рисунок 1: Графическое представление подготовки субстрата ДНК. (A) Биотинилированный конец вилки ДНК создается путем отжига двух частично комплементарных олигонуклеотидов: биотинилированного и небиотинилированного. (B) Основной фрагмент дцДНК (~20 kb) генерируется путем рестрикционного расщепления плазмиды pGC261 двумя ферментами для создания линейной ДНК с различными выступами на каждом конце. (C) Конец дуплексной ДНК дигоксигенина получают путем ПЦР-реакции, проводимой в присутствии дигоксигенина-dUTP, с последующим рестрикционным расщеплением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
2. Очистка Drosophila melanogaster CMG (Рисунок 2)
Рисунок 2: Очистка Drosophila melanogaster CMG из 4 л клеток Hi Five. Белки растворяли на 4%-12% полиакриламидном геле Bis-Tris при 200 В в присутствии буфера MOPS. Образец показывают на каждой стадии очистки (лизат клеток - 2 μл, элюирование FLAG - 10 μл, после первой ионообменной колонки - 10 μл, а после мечения и второй ионообменной колонки - 1 μл. (А) окрашивание Кумасси подтверждает наличие всех 11 субъединиц комплекса CMG до (10 μл), и после (1 μл) флуоресцентного мечения. (B) Эффективность мечения субъединицы MCM3 была проверена путем сканирования Cy5 с помощью флуоресцентного анализатора изображений с использованием длинночастотного красного фильтра (LPR). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Примечание: Для получения флуоресцентно меченого Drosophila melanogaster CMG сайт расщепления TEV (ENLYFQG), за которым следуют четыре остатка Gly, вводили после N-концевой метки FLAG на субъединице MCM3 (в векторе pFastBac1)10. Для экспрессии комплекса использовалась система экспрессии бакуловируса. Для первичной трансфекции клетки Sf21 использовали отдельно для каждой субъединицы CMG (стадия вируса P1). Для дальнейшей амплификации вирусов использовали клетки Sf9 (стадия вируса P2). Впоследствии клеточные культуры Sf9 (100 мл для каждой субъединицы CMG; 0,5 x 106 клеток/мл) инфицировали 0,5 мл вируса P2 с добавлением 10% сыворотки эмбрионального теленка (стадия вируса P3). Для экспрессии всего комплекса CMG в 4 л клеток Hi Five (1 x 106 клеток/мл) использовали по 200 мл вирусов P3 для каждой из субъединиц. После сбора клеток Hi Five, экспрессирующих комплекс CMG, гранулу клетки можно мгновенно заморозить в жидком азоте и хранить при температуре -80°C. Проведите всю очистку на льду или при температуре 4 °C. Буферы могут быть приготовлены заранее, при условии, что восстановители (DTT или 2-меркаптоэтанол) и ингибиторы протеазы (CAUTION) добавляются непосредственно перед использованием. Убедитесь, что все буферы предварительно охлаждены, отфильтрованы и дегазированы.
3. Подготовка проточной ячейки (Рисунок 3)
Иллюстрация 3: Графическое изображение подготовки проточной ячейки. (A) Отрежьте двустороннюю ленту в соответствии с размером стеклянной детали. Выровняйте горку поверх ленты и отметьте иголкой положение каждого отверстия. С помощью лезвия бритвы разрежьте вокруг каждого зацепа, чтобы создать канал. (B) Отклейте одну сторону ленты и приклейте ленту к стеклянной части. Убедитесь, что оба отверстия находятся внутри канала. Снимите второй конец ленты и приклейте сверху покровное стекло биотин-ПЭГ. (C) Вставьте полиэтиленовую трубку в каждое отверстие и запечатайте трубку на месте эпоксидной смолой, приклеив каждую стеклянную деталь к покровному стеклу. (D) После использования обоих каналов вытащите трубку и поместите проточную ячейку в банку для окрашивания, наполненную ацетоном. Примерно через 24 часа эпоксидная смола и лента станут мягкими, и слои проточной ячейки можно будет отделить. Кусочки стекла могут быть восстановлены и храниться в ацетоне для повторного использования в течение неограниченного срока для изготовления следующей проточной ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
4. Анализ одной молекулы TIRF для визуализации CMG-опосредованного раскручивания ДНК
Рисунок 4: Привязка ДНК к поверхности. (А) При связывании субстратов ДНК с биотином на обоих концах расстояние между двумя тросами может варьироваться в зависимости от того, как концы соприкасаются с поверхностью (i). Используя дигоксигенин на одном конце, привязка каждого конца может быть временно разделена для получения более постоянных расстояний между связями и более равномерно растянутой ДНК (ii). (B) Пример поля зрения, показывающий ДНК, привязанную с обоих концов (меченую дигоксигенином) и окрашенную флуоресцентным интеркалирующим окрашиванием нуклеиновой кислоты. ДНК, которая связана обоими концами, выглядит как линия, в то время как ДНК, связанная только одним концом, выглядит как пятна. В идеале ДНК должна быть связана как можно плотнее, не перекрывая другую ДНК. Изображение имеет размер 512 x 512 пикселей (размер пикселя = 154,6 нм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Когда CMG раскручивает ДНК, характерный тракт RPA со временем будет расти (рис. 5). 5'-конец раскрученной ДНК привязан к поверхности; следовательно, он рассматривается как линейный участок сигнала RPA между тросом и вилкой. 3'-конец не привязан и, следовательно, движется вместе с вилкой и наблюдается как компактный сигнал EGFP-RPA. Положение уплотненной размотанной транслокационной нити примерно соответствует положению репликационной вилки, которая перемещается вместе с LD655-CMG, визуализируемым с помощью лазера с длиной волны 640 нм.
Важно свести к минимуму повреждение субстрата ДНК, так как такие повреждения, как одноцепочечные дефекты ДНК, уменьшают количество наблюдаемых событий раскручивания, ограничивая объем данных, которые могут быть собраны (рис. 6).
Рисунок 5: Анализ раскручивания одномолекулярной ДНК. Субстрат ДНК привязан к покровной поверхности. Очищенный CMG, меченный LD655, инкубируют с ДНК в течение 15 мин в АТФ-g-s. Добавляются АТФ и очищенная EGFP-меченая RPA, что инициирует обширное раскручивание ДНК CMG. Показана мультяшная схема (слева) и кимография репрезентативных данных (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 6: Повреждение ДНК снижает производительность анализа. (A) CMG не может раскручивать ДНК после разрыва в костяке ДНК (DNA nick). Зазубрины на матрице ведущей цепи приводят к соскальзыванию CMG с ДНК, и обе матрицы CMG и ведущей цепи теряются. Зазубрин на шаблоне отстающей цепи приводит к тому, что шаблон отстающей цепи отделяется от остальной части ДНК, и каждый фрагмент ДНК втягивается к соответствующему тросу. Это иллюстрируется (i) мультяшными схемами и (ii) кимографиями этих событий; (ii). Репрезентативные данные с (В) минимально поврежденным субстратом ДНК по сравнению с (В) более поврежденным субстратом ДНК через (i) 5 мин, (ii) 15 мин и (iii) 60 мин в одном поле зрения. Более поврежденный субстрат ДНК не генерирует длинных отрезков разматывания, как СМГ сталкиваются с зазубринами ранее, несмотря на схожие уровни активности разматывания (одинаковая плотность растущих пятен RPA через 5 минут, что указывает на аналогичную эффективность загрузки/размотывания КМГ). Поле зрения составляет 512 x 512 пикселей (размер пикселя = 154,6 нм). Мощность лазера 1% (488 нм) для визуализации EGFP-RPA. Масштабная линейка 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Этот анализ обеспечивает платформу для наблюдения и исследования динамики отдельных CMG в режиме реального времени, как изолированно, так и в контексте желаемых дополнительных факторов. Однако, как и во многих методах флуоресценции с использованием одиночных молекул, существуют некоторые общие проблемы, для преодоления которых может потребоваться оптимизация. Обычно они связаны с визуализацией флуорофоров в течение длительных периодов времени (фотообесцвечивание, яркость), подготовкой субстрата ДНК (повреждение ДНК), качеством поверхности проточной ячейки (фоновый шум, неспецифические взаимодействия) или качеством очищенного белкового препарата (загрязнение нуклеазами, эффективность мечения).
Каждый флуорофор различается по светостабильности и яркости, поэтому важно выбрать подходящую молекулу. При визуализации флуоресцентно меченных олигомерных белков, таких как RPA, можно использовать более низкую мощность лазера, так как многие флуорофоры будут возбуждаться в непосредственной близости, генерируя видимый сигнал. Для визуализации отдельных флуорофоров, например, CMG, меченных на одной субъединице, требуется более высокая мощность лазера, чтобы четко наблюдать флуорофор. Срок службы флуорофора может быть увеличен за счет минимизации лазерного воздействия, например, за счет уменьшения частоты получения изображений. Кроме того, возбуждение флуорофора приводит к образованию активных форм кислорода (АФК), которые могут способствовать фотообесцвечиванию. Включение системы очистки кислорода в буфер визуализации может продлить срок службы флуорофоров за счет устранения АФК. Тем не менее, некоторые системы поглощения кислорода могут влиять на pH12.
Что касается подготовки субстрата ДНК, крайне важно свести к минимуму повреждения ДНК, такие как зазубрины или одноцепочечные промежутки. Чрезмерное повреждение препятствует обширному раскручиванию ДНК, ограничивая объем данных, которые могут быть собраны. Повреждение может возникнуть в результате механического сдвига, чрезмерного нагрева, в результате загрязнения нуклеазами или АФК, образующихся во время визуализации. Сдвиг можно свести к минимуму, если бережно обращаться с образцом ДНК с помощью широкопроходных наконечников для пипетирования, медленного пипетирования и избегания перелистывания образца. Эффект АФК может быть сведен к минимуму либо за счет уменьшения лазерной нагрузки, либо за счет включения системы очистки кислорода в буфер изображения. После подготовки субстрата ДНК можно использовать коммерческие наборы для восстановления ДНК для восстановления повреждения перед проведением реакции раскручивания.
Эффективность раскручивания ДНК также зависит от чистоты и активности КМГ. Хорошей практикой является оценка чистоты образца после каждого этапа очистки с помощью электрофореза SDS-PAGE, чтобы определить, где необходима оптимизация. Если после заключительного этапа наблюдается слишком большое количество загрязняющих веществ, может быть полезно изменить объемы градиента соли, используемые для элюирования из колонки CaptoHiRes Q (5/50). Также очень важно удалить избыток флуоресцентного пептида, используемого для мечения белка, так как он может создать нежелательный фон на поверхности покровного стекла. Также важно избегать загрязнения нуклеазами, так как это может привести к разрушению субстрата ДНК. После эксперимента окрашивание оставшейся ДНК в оранжевый цвет SYTOX может быть хорошим способом проверить, значительно ли деградировала ДНК или нет. Определенный уровень повреждения ДНК неизбежен в ходе эксперимента, но значительные повреждения часто указывают на проблемное загрязнение нуклеазами.
Анализ также по своей сути ограничен разрешением дифракционно-ограниченных пятен, что требует, чтобы флуоресцентные белки находились на расстоянии сотен пар оснований (если не больше), чтобы различать их как отдельные. Это ограничивает детализацию, с которой можно наблюдать прогрессирование КМГ и взаимодействия.
Количество событий раскручивания, которые мы наблюдаем для каждого анализа, варьируется. Для успешного эксперимента мы ожидаем увидеть как минимум несколько RPA-трактов достаточной длины на поле зрения 512x512 пикселей (размер пикселя = 154,6 нм). В одном эксперименте можно визуализировать несколько полей зрения, что позволяет собирать больше данных при необходимости. Тракты не обязательно должны быть одинаковой длины или доходить до конца ДНК, чтобы быть полезными. Например, среднее расстояние до троса для каждого эксперимента можно определить, измерив длину окрашенной SYTOX ДНК перед добавлением CMG. Это может быть использовано для оценки того, сколько ДНК было раскручено для любого RPA-тракта (при условии, что ДНК достаточно для видимого перемещения вилки) путем преобразования расстояния от «пройдено μm» до «kb раскручено».
CMG проявляет разматывающую активность на различных субстратах ДНК, но важно обеспечить свободный 3'-конец ДНК на лоскуте polyT с углом не менее 30 нт, чтобы обеспечить посадочное место CMG10. Включение нескольких биотиновых фрагментов на вилке обеспечивает надежную поверхностную привязку. Остальная часть субстрата ДНК может быть перепроектирована множеством способов, например, с включением различных последовательностей ДНК, длины и химических модификаций. Конформация ДНК может быть изменена при использовании различных концентраций ацетата магния. При более высоких концентрациях (≥10 мМ) ацетата магния нить одноцеклеточной ДНК, покрытая RPA, уплотняется, что приводит к тому, что ДНК вытягивается за счет связывания RPA во время раскручивания. Это может быть полезно, так как предотвращает чрезмерное перемещение ДНК, позволяя более точно измерить положение CMG и прогрессию раскручивания. При низких концентрациях (~3 мМ) ацетата магния RPA-ssDNA остается расслабленной на протяжении всего процесса.
Описанный анализ на основе одной молекулы представляет собой платформу, которая может быть построена и модифицирована для исследования дальнейших аспектов репликации ДНК. Во время репликации ДНК CMG выступает в качестве ядра, вокруг которого собирается репсисома и ее компоненты. Таким образом, в этот анализ могут быть добавлены дополнительные очищенные белки, включая вспомогательные факторы, такие как TIMELESS, TIPIN и CLASPIN, для изучения их влияния на динамику CMG. Было показано, что эти белки влияют на скорость репликациивилок 13, но неясно, как они влияют на скорость раскручивания CMG. Поэтому было бы интересно исследовать, как различные реплисомные белки влияют на CMG с помощью этого анализа. Добавление ДНК-полимераз может дать лучшее представление о репликации ДНК, выходящей за рамки только раскручивания ДНК, как описано ранее на примере белков дрожжей14. Кроме того, очистка модифицированного CMG может обеспечить лучшее понимание того, как определенные мутации или посттрансляционные модификации влияют на активность геликазы15,16. Кроме того, проектирование различных субстратов ДНК может позволить изучать раскручивание ДНК методом CMG в различных условиях, имитирующих репликационный стресс17. Эти модификации включают препятствия 9,18 ДНК, межцепочечные сшивки 19,20,21 и разрывы в цепяхДНК 22.
Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов.
Мы благодарим Георге Кистола за предоставление плазмиды pGC261 и Центр химической биологии Института Фрэнсиса Крика за синтез и мечение пептидов. Эта работа финансировалась Институтом Фрэнсиса Крика, который получает основное финансирование от Cancer Research UK, UK Medical Research Council и The Wellcome Trust (CC2133).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | |
Acrylamide / Bis Solution 40% | BioRad | 1610148 | |
Agarose UltraPure | Invitrogen | 16500-500 | Used to prepare Tris Buffer (pH 8) |
ÄKTA Pure | GE Healthcare | - | Used with Fraction Collector F9-C; protein purification system |
ANTI-FLAG M2 affinity gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
APS 10% | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
ATP (200 mM) | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
ATP-g-s (100 mM) | Sigma-Aldrich | 11162306001 | |
Biotin-PEG coverslip | N/A | N/A | Prepared as described: https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2012.03.033 |
Biotinylated anti-digoxigenin antibody | Perkin Elmer | N/A | |
Blu Tack | Bostik | N/A | Adhesive putty |
Boric acid | Thermo Fisher Scientific | B/3800/53 | |
BSA; 33 mg/mL | SIGMA-ALDRICH | A3858-10G | Diluted from the stock |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
CaptoHiRes Q (5/50) | Cytiva | 29275878 | Connected to the AKTA protein purification system; high-resolution ion exchange chromatography column |
Casein (5% in water, 50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | C4765-10ML | |
ChemiDoc system | Bio-Rad | N/A | |
Clips | N/A | N/A | |
Cutting board | N/A | N/A | |
Dialysis tubing (3.5 kDa) | Fisher Scientific | 11425859 | |
digoxigenin-11-dUTP | Roche | 11209256910 | |
DNA loading dye 6x | NEB | B7024S | |
dNTP 10 mM | NEB | N0447S | |
Double-sided tape (0.14 mm thick) | N/A | N/A | |
DTT | Fluorochem Limited | M02712-10G | |
DYKDDDDK peptide | N/A | N/A | Synthetised by chemical biology STP of The Francis Crick Institute |
EDTA | Thermo Fisher Scientific | D/0700/68 | |
EGFP-RPA | N/A | N/A | Purified as desribed in ‘Single Molecule Analysis’, Series Methods in Molecular Biology, Vol. 783 (2011), Peterman, E. J. G. and Wuite G. J. L. editors, Humana Press. Protein information: 2 mM, human, expressed in E. coli. |
EGTA | Sigma-Aldrich | 03779-10G | |
Epoxy - 5 minute | Devcon | 20845 | |
Fujifilm FLA-5000 | Fujifilm | FLA-5000 | Fluorescent image analyzer |
GelRed Nucleic Acid Stain; 10000x | Cambridge Bioscience | 41003-BT | Example of nucleic acid stain which is a safer alternative to ethidium bromide. |
Glass or quartz slide with holes for tubing | Dremel Model 395 | 1 mm thick slide, cut to 2.4 cm x 1cm, two holes drilled 1.4 mm apart. The holes should be drilled to different sizes to accommodate different tubing at each end. | |
Glycerol | Fisher Scientific | G/0650/17 | |
Glycine HCl, pH 3.5 | Sigma-Aldrich | G8898 | |
Hamilton syringe, 1000 series GASTIGHT, PTFE luer lock 1010TLL, PTFE Luer lock (with slots), volume 10 mL | Merck | 26211-U | |
HEPES pH 7.5 | Sigma-Aldrich | H4034 | |
I-CeuI | NEB | R0699L | |
KCl | Fisher Scientific | P/4280/53 | |
Magnesium acetate | Sigma-Aldrich | M2545 | |
Maxi GeBaFlex-tube Dialysis Kit; MWCO 14 kDa | Generon | D055 | |
Metal spatula | N/A | N/A | |
Metal tweezers | N/A | N/A | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
Millex-GP (Syringe filters) 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Needle | N/A | N/A | |
NotI-HF | NEB | R3189L | |
NuPAGE 4%–12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | 10247002; | |
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific | NP0001 | |
Objective heater | Okolab | N/A | |
PCR mix - 2x | Prepared from Phusion DNA polymerase (20 µL), 10 mM dNTPs (40 µL), 5x Phusion HF buffer (400 µL) and water (540 µL). | ||
Peptide NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH, labelled with LD655-MAL | N/A | N/A | peptide NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH, labeled with LD655-MAL (Lumidyne Technologies) on the cysteine residue, was synthetised and purified by the peptide chemistry STP of The Francis Crick Institute |
pGC261 plasmid | N/A | N/A | https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.10.053 |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
Plastic tweezers | N/A | N/A | |
Polyethylene tubing PE20 (inner diameter 0.015”, outer diameter 0.043”) | Becton Dickinson | 427406 | |
Polyethylene tubing PE60 (inner diameter 0.03”, outer diameter 0.048”) | Becton Dickinson | 427416 | |
Poly-Prep Chromatography Columns; 10 ml and 20 ml | Bio-Rad | 7311550 | |
Potassium Glutamate (L-glutamic acid potassium salt monohydrate) | Sigma | G1501-1KG | |
Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA free) | Roche | 5056489001 | |
Pump 11 Elite Infusion/Withdrawal Programmable Single Syringe | Harvard Apparatus | 70-4504 | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
Razor blade | VWR International Ltd | 233-0156 | |
rCutSmart Buffer; 10x | NEB | B6004S | |
Sodium acetate | Thermo Fisher Scientific | S/2120/53 | |
Sortase (pentamutant) | N/A | N/A | Purified based on: https://doi.org/10.1073/pnas.1101046108 |
Spin-X Centrifuge Tube Filters; 0.22 µm cellulose acetate | Fisher Scientific | 10310361 | |
Sterile scalpel | N/A | N/A | |
Steritop Vacuum Driven Disposable Filtration System; 0.22 um; PES; | Millipore | S2GPT05RE | |
Streptavidin (1 mg/mL) in 1x PBS buffer | Sigma | S4762-10MG | 20 µL aliquotes |
SYBR Gold | Thermo Fisher Scientific | S11494 | Highly sensitive nucleic acid stain we used to visualise DNA fork substrate. |
SYTOX orange; 5 µM in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
T4 DNA ligase | NEB | M0202M | |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
TEMED | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | |
TEV protease (1 mg/mL); EZCut | Biovision | 7847-10000 | |
Tissue grinders, Dounce type (40 mL, Wheaton) | DWK Life Sciences | 432-1273 | |
Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | Used to prepare Tris Buffer (pH 8) |
Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Tween-20 | Promega UK Ltd | H5152 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены