Nous tenons à remercier Sandra Bargen pour le soutien technique excellente. Ce travail a été soutenu par le département de recherche sur les protéines (PRD, TP A1.2 (RC et TS), et la recherche RUB Fond, Rektoratsprogramme -. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) Les anticorps monoclonaux et les 39.4D5 F55A10 ont été obtenus à partir de l&#39;hybridome études développementales Bank (DSHB, Iowa City, IA).

Pour les réactifs spéciaux: voir Tab. 1. Tous les autres réactifs sont mentionnés dans la qualité de grade culture cellulaire obtenue chez Sigma Aldrich. 1. Revêtement PORN-H/laminin des plats / lamelles <ol><li> Préparer la solution de travail de 0,5 mg / ml de poly-DL-ornithine bromhydrate (PORN-H) dans 150 mM de tampon borate de pH 8,35. <ol><li> Une solution stock de 50 mg PORN / 1 ml de tampon borate peut être préparé à l&#39;avance et stocké à -20 ° C. </li></ol></li><li> Stériliser lamelles de verre à la flamme dans l&#39;éthanol 100% et laissez-les sécher à l&#39;air. </li><li> Couvrir la surface avec suffisamment de porn-H solution de nuit à 4 ° C. </li><li> Le lendemain laver trois fois avec de l&#39;eau stérilisée et sécher à l&#39;air des lamelles. </li><li> Préparer la solution de travail de 2,5 pg / ml de laminine dans HBSS <ol><li> Aliquotes peuvent être stockés à -20 ° C. Décongeler à 4 ° C immédiatement avant l&#39;utilisation. </li></ol></li><li> Couvrir la surface du couvre-PORNO-H-revêtu de la solution la laminine et les laisser incuber pendant au moins 2 h à température ambiante jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 2. Revêtement de lectine de la plaque d&#39;épuration <ol><li> Préparer une solution de Tris 10 mM dans de l&#39;eau stérilisée, pH 9,5. </li><li> Ajouter lectine (résoudre la lectine (Sigma L9640) de poudre dans HBSS) à une concentration finale de 10 pg / ml. </li><li> Enduire la surface d&#39;un plat de 10 cm de culture cellulaire avec 8 ml de la solution de lectine et laisser incuber pendant au moins 30 min à température ambiante. </li><li> Laver la plaque trois fois avec HBSS et stocker dans HBSS jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Préparer un 30 mM KCl, 0,8% (p / v) de NaCl dépolarisation-solution. Stériliser par filtration et stocker à température ambiante (RT). </li></ol> 3. Milieu de culture des motoneurones <ol><li> Cheval de dégeler le sérum nuit à 4 ° C et inactiver à 55 ° C pendant 30 min, Aliquoter en 5 ml et conserver à -20 ° C. Aliquote de dégel directement avant de l&#39;utiliser à température ambiante. </li><li> Boutique B27-supplément dans une aliqouts ml à -20 ° C. Dégel B27 complément à la température ambiante immédiatement avant utilisation. Éviter les cycles de gel et de dégel. </li><li> Glutamax Aliquoter en aliquots de 0,5 ml et conserver à -20 ° C et l&#39;utiliser à 1:100. </li><li> Préparer une solution stock de 10 ug / ml dans le CNTF eau stérilisée avec la BSA à 0,1%. Conserver à -20 ° C. </li><li> Mélangez 46 ml de milieu neurobasal avec 2,5 ml de sérum de chevaux, 1 ml B27-complément et 0,5 ml glutamax directement avant l&#39;utilisation. </li><li> Ajouter CNTF à une concentration finale de 10 ng / ml de milieu et préchauffer à moyen et à 37 ° C. </li></ol> 4. Dissection de la moelle épinière <ol><li> Sacrifice d&#39;une souris E12.5 enceintes et enlever les embryons soigneusement. Ajouter suffisamment RT HBSS pour couvrir complètement les embryons. </li><li> Retirez la tête et la queue et le lieu de la face arrière d&#39;embryon avec des membres enfourché. </li><li> Fixer l&#39;embryon avec une pince et retirer la peau externe avec la pince d&#39;autres. </li><li> Retirer la moelle épinière en perçant la pince sous lui et il lève avec les mouvements de scie des deux côtés de la moelle épinière. </li><li> Transférer la moelle épinière isolée d&#39;un nouveau plat avec HBSS et ouvrir le canal central de la moelle épinière sur la face dorsale. </li><li> Retirez les ganglions rachidiens en supprimant les méninges entourant la moelle épinière. </li><li> Ramassez les pièces lombaire de la moelle épinière de jusqu&#39;à 6 embryons par plaque lectine dans un tube de réaction Eppendorf remplis avec HBSS 1 ml et stocker sur la glace jusqu&#39;à ce que la préparation est faite. </li></ol> 5. Enrichissement des motoneurones par la lectine à base de purification Remarque: Avant de commencer les prochaines étapes, la dernière ici, préparer et préchauffer le support (voir l&#39;étape 3.) <ol><li> Préparer une solution de trypsine par la résolution 1 g de trypsine dans du HBSS de 100 ml, conserver à -20 ° C et laisser décongeler à 4 ° C. </li><li> Mélanger 1g trypsine-inhibiteur avec 98 ml de HBSS et 2 ml d&#39;une M pH 7,4 HEPES, aliquotes de 1 ml doivent être conservés à 4 ° C. </li><li> Transférer le tube avec la moelle épinière d&#39;une hotte de culture cellulaire et retirez soigneusement 700 pl de la HBSS. </li><li> Ajouter 7,5 ul solution de trypsine et mélanger en inversant le tube soigneusement. </li><li> Effectuer trypsination pendant 8 min à 37 ° C. </li><li> Arrêter la réaction par addition de 30 ul inhibiteur de la trypsine et la pipette de haut en bas (triturer) attentivement 10-15 fois avec une pointe de pipette 1000 ul jusqu&#39;au agrégats cellulaires sont plus visibles. Répétez la trituration avec une pipette de 20 à 200 ul et la pointe correspondante. </li><li> Pipeter la solution de cellules dans la plaque HBSS rempli de lectine et de disperser les cellules en faisant tourner la plaque. </li><li> Conservez la plaque lectine pendant 60 min à température ambiante sur une surface exempte de vibrations. Couvrir pour éviter toute contamination. </li><li> Retirez le HBSS très doucement et laver soigneusement la plaque 4 fois avec préchauffé HBSS pour éliminer les fragments de cellules et les cellules non attachées / seules. </li><li> Immédiatement après la dernière étape de lavage, ajouter 500 ul solution de dépolarisation de la plaque et laisser incuber pendant 1min. </li><li> Faciliter le détachement des cellules lectine liée par des tremblements etfrappant la plaque. </li><li> Remplir la plaque avec 2 ml milieu de culture pré-chauffé et le transfert d&#39;un tube Falcon de 15 ml. </li><li> Comptez le nombre de cellules avec une chambre de comptage Neubauer. </li><li> Assiette de la cellule sur les lamelles de la laminine enduits ou plaques dans un nombre approprié selon l&#39;application. </li><li> Effectuer un échange de support le jour 1 et ensuite tous les deux jours par remplacement minutieuse de 50% de l&#39;ancien milieu. Toujours utiliser des pré-chauffée, un milieu fraîchement préparé une nouvelle culture. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Motoneurones embryonnaires peuvent être obtenues à partir d&#39;embryons de souris à E12 à E14. 2-3% de la population totale des cellules de la moelle épinière lombaire se compose des motoneurones et les neurones ganglionnaires de la racine dorsale sont p75 NTR-positifs ainsi, il est important de se débarrasser de ces cellules avant de commencer la procédure preplating lectine base ( Pour un aperçu voir Figure 1 et Figure 2). Deuxièmement, les méninges notamment des cellules fortement divisant qui devraient être exclus aussi, comme ils ne peuvent pas être correctement supprimés par la procédure preplating lectine base (Figure 2 et Figure 3). Dans le pire des cas, ces cellules peuvent proliférer les plaques de culture. Les images représentant la figure 3B et 3D aussi donner une impression sur la plus faible densité cellulaire après le lavage des procédures ont été effectuées (voir l&#39;étape 5.9 du protocole). Les cultures de motoneurones embryonnaires de souris sont généralement maintenues jusqu&#39;à cinq ou sept jours. Durant cette période, les cellules établissent leurs neurites jusqu&#39;à une longueur maximale (figure 4). Longueurs neurites dépendent fortement du substrat sur ​​les 8 assiettes. Le substrat typique est la laminine qui est couché sur porn-H boîtes de culture couverte. Motoneurones peuvent également se développer sur d&#39;autres substrats ou moins définis, comme les matrices extracellulaires générés par 8 lyse de l&#39;eau. En cas de revêtement, la longueur des neurites et la zone sous-optimale du cône de croissance sont réduites et la mort cellulaire augmente habituellement. Support trophique joue un rôle crucial pour la survie des motoneurones embryonnaires de souris en culture. La survie des cellules initialement plaqué sur sept jours chuter à 10% à 20% sans appui 6 trophiques. Facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) et le facteur neurotrophique ciliaire (CNTF) sont les facteurs les plus couramment utilisés mais d&#39;autres peuvent favoriser la survie aussi bien [facteur inhibiteur de leucémie (LIF), Cardiotrophin-1 (CT-1), facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF ), Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) 9]. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig1.jpg" /> Schéma de la figure 1. Pour la préparation des motoneurones embryonnaires de souris. Le schéma illustre les différentes étapes pour l&#39;isolement et la culture des motoneurones embryonnaires de souris. Abréviations: SC: la moelle épinière; HBSS: solution saline équilibrée de Hanks, MN: motoneurone. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig2.jpg" /> Figure 2: Isolement de la partie lombaire de la moelle épinière de souris E12.5 A:.. E12.5 embryon de souris. Pour l&#39;étape suivante, la tête et la queue sont supprimés et le corps est placé dans une position dorsale B-up: l&#39;embryon dans une position dorsale-up. Pince à gauche et à droite de la moelle épinière sont la fixation du corps de l&#39;embryon dans sa position. Un des forceps est ensuite utilisé pour couper la peau et à réduire au-dessous de la moelle épinière que l&#39;autre est utilisée pour fixer l&#39;embryon dans sa position C:. Isolé de la moelle épinière à partir d&#39;embryons de souris E12.5. Les parties de la moelle épinière (cervicale, thoracique, lombaire) sont indiqués. La moelle épinière est entourée par les méninges et une partie du ganglion de la racine dorsale encore y attacher D:. La moelle épinière est coupé longitudinalement sur ​​la face dorsale de l&#39;ouvrir vers le canal central E:. Les méninges sur la face ventrale sont maintenant prises hors de la moelle épinière aplati. Note: Bien pris son envol, la partie lombaire est marquée par une petite coupure F:. Seule la partie lombaire de la moelle épinière est alors pris pour d&#39;autres procédures. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig3.jpg" /> Figure 3: Détermination et l&#39;isolement des îlots de cellules positives de la moelle épinière lombaire des embryons de souris E12.5 A:.. Les étiquettes Islet-1 / 2 d&#39;anticorps colonnes motoneurone dans la moelle épinière lombaire embryonnaire (rouge, flèche) et des étiquettes Hoechst tous les noyaux au sein de la section. Coupe transversale d&#39;un cordon Lumar E12.5 épinière. E12.5 embryons de souris ont été fixés dans l&#39;immersion-paraformaldéhyde à 4% pendant 6 h, lavée 3 fois avec du tampon phosphate salin et traitée avec du saccharose selon des procédures standard. Cryocoupes de 20 um ont été prises avec un cryostat et les sections ont été traitées pour la coloration immunohistochimique selon les procédures habituelles 11. Les sections Ware suite étiqueté avec Hoechst pour la localisation des noyaux cellulaires. Notez queles neurones ganglionnaires de la racine dorsale sont Islet-1/2-positive ainsi et que la procédure de préparation des pièces exclut ce tissu de la procédure d&#39;isolement B:. Islet-1 / 2 étiquetés (rouge, flèche) dissocié lombaires cellules de la moelle épinière du E12. 5 embryons, gauche - avant et à droite - après lectine basé preplating. Les cellules ont été contre-colorées avec Hoechst pour visualiser tous les noyaux des cellules C:. Quantification des cellules Islet-1/2-positive avant et après la lectine à base preplating D:. Nkx6.1 motoneurones marqué à partir de E12.5 embryons après une journée dans la culture. Les cellules ont été contre-colorées avec Hoechst pour cisualieze tous les noyaux. Notez que 90% de toutes les cellules sont Nkx6.1 positif. Abréviations: SC: la moelle épinière; MN: motoneurone; DRG: ganglion de la racine dorsale. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig4.jpg" /> Figure 4 Caractérisation des motoneurones de souris E12.5 A et B:.. Enrichi isolées de souris E12.5 motoneurones spinaux lombaires exprimer p75 NTR à 0 jours in vitro (0div) et le jour 2 in vitro (2div). Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde 4% et ensuite colorées pour p75 NTR conformément aux procédures standard. Les cellules ont été contre l&#39;aide de Hoechst pour visualiser tous les noyaux C:. Motoneurones Enrichi après 5 jours in vitro (5div) sur porn-H et la laminine comme substrats de culture et en présence de vitraux pour la CNTF β-III-tubuline. Notez que les cellules se sont développées hors neurites longs et afficher la morphologie du motoneurone typique avec un plus long (ramifié) processus et un ou plusieurs processus plus courts (axones et dendrites). Abréviations: MN: motoneurone; div: jours in vitro. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="3"> Après la dissociation sans lectine basé preplating </td></tr><tr><td> Le nombre total de cellules / SC </td><td> Bleu Trypan de cellules positives [%] </td><td> Cellules positives Islet-1/2- [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 995,0 </td><td> 13,1 </td><td> 9,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 889,4 </td><td> 8,0 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1.180.0 </td><td> 11,0 </td><td> 10,8 </td></tr><tr><td> Moyenne ± SD </td><td> 1.021.0 147,1 ± </td><td> 10,7 ± 2,6 </td><td> 10,1 ± 0,7 </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td> Avec lectine basé preplating </td></tr><tr><td> Nombre de cellules après preplating / SC </td><td> Bleu Trypan de cellules positives [%] </td><td> Cellules positives Islet-1/2- [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 189,6 </td><td> 9,9 </td><td> 70,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 168,8 </td><td> 3,7 </td><td> 76,1 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 125,0 </td><td> 0,0 </td><td> 72,5 </td></tr><tr><td> Moyenne ± SD </td><td> 161,1 ± 33,0 </td><td> 4,5 ± 5,0 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Sommaire des résultats des procédures d&#39;isolement représentant de motoneurones embryonnaires de souris du stade E12.5. À partir de 3 différentes procédures d&#39;isolement spécialement à cet effet sont donnés comme le nombre total ou les numéros de pourcentage ± SD. Abréviation: LC: la moelle épinière; SD: déviation standard. <table border="1"><tbody><tr><td> Islet-1 / 2 cellules positives avec p75 panoramique [%] </td><td> Islet-1 / 2 cellules positives avec la lectine basée panoramique [%] </td></tr><tr><td> 92,0 ± 3,5 1 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Résultats de comparaison de lectine à base et p75-1 à base de panoramiques nombre de cellules des motoneurones. Numéros sont donnés à titre pourcentage ± SD.

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	<li>Vallstedt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+levels+of+repressor+activity+assign+redundant+and+specific+roles+to+Nkx6+genes+in+motor+neuron+and+interneuron+specification.">Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification.</a> Neuron. 31, 743-755 (2001).</li><li>Tsuchida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+organization+of+embryonic+motor+neurons+defined+by+expression+of+LIM+homeobox+genes.">Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes.</a> Cell. 79, 957-970 (1994).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+related+motor+neuron+pool+and+muscle+sensory+afferent+subtypes+defined+by+coordinate+ETS+gene+expression.">Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression.</a> Cell. 95, 393-407 (1998).</li><li>Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+for+survival+of+lesioned+motoneurons.">Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons.</a> Acta Neurochir. , 21-35 (2004).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery.">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li><li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entering+the+Portal:+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope.">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li><li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo.">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li><li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis.">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration.">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li><li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+accelerates,+but+is+not+required+for,+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP.">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

L&#39;avantage de cette technique basée sur preplating lectine, c&#39;est qu&#39;il est moins cher que le p75 NTR procédure basée sur le panoramique, et la lectine est plus stable que les anticorps. L&#39;enrichissement énumérés dans la Fig. 2 et Tab. 1 montre que la procédure permet à la purification des nombres similaires de cellules et que la majorité de ces cellules expriment le marqueur motoneurone Islet-1 / 2. L&#39;étape la plus critique est la procédure d&#39;isolement de la moelle épinière lombaire. Suppression des méninges et de la DRG (Fig. 2) est indispensable pour la procédure de purification par la suite lectine basé preplating. Si cela a été géré correctement, presque toutes les cellules expriment la p75 NTR (pour l&#39;image représentant voir Fig. 3a). La raison de la différence entre l&#39;expression de l&#39;Islet-1 / 2 et p75 NTR est très probablement parce que motoneurones lombaires différentielle expriment des niveaux supérieurs et inférieurs de l&#39;Islet-1 / 2 10. En cas de faibles niveaux de l&#39;Islet-1 / 2 d&#39;expression que cela pourrait avoir échappé à notre attention dans la coloration et le comptage immuncytochemical ultérieures que nous avons été sévères à l&#39;égard de cellules positives contre un solde négatif (Tab. 1). De plus, le tableau 1 montre clairement que les cellules isolées survivent à la procédure dans un état sain, car il ya seulement quelques trypan bleu cellules positives qui indiquent que les cellules sont endommagées de façon irréversible. Cette procédure permet également l&#39;isolement altératives des motoneurones à partir d&#39;embryons unique et donc des portées génotype mixte de souris embryonnaires. En conclusion, cette alternative à la procédure panoramique avec l&#39;anticorps p75 NTR 6 a même s&#39;ils ne sont pas des capacités identiques en termes de domaines d&#39;application possibles et fournit une méthode de purification efficace et bon marché alternatif pour motoneurones embryonnaires de souris.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Poly-DL-ornithine bromhydrate </td><td> Sigma </td><td> P8638 </td><td></td></tr><tr><td> La laminine </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Verre lamelles </td><td> Thermo </td><td></td><td> Ø 10 ou 14mm </td></tr><tr><td> Lectine </td><td> Sigma </td><td> L5142 </td><td></td></tr><tr><td> Boîte de culture cellulaire </td><td> Nunc </td><td> 150350 </td><td> Nunclon delta de la surface </td></tr><tr><td> Sérum de cheval </td><td> Linaris </td><td> SHD3250ZK </td><td> Chaque lot doit être testé pour la culture MN </td></tr><tr><td> B27 Supplément </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-038 </td><td></td></tr><tr><td> CNTF </td><td> Sigma </td><td> N0513 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Applichem </td><td> A1391 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-041 </td><td></td></tr><tr><td> Forceps </td><td></td><td></td><td> Acier inoxydable, taille 4 ou 5 </td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Worthington </td><td> LS003707 </td><td></td></tr><tr><td> La trypsine-inhibiteur </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Islet-1 </td><td> DSHB </td><td> 39.4D5 </td><td> Surnageant de culture cellulaire </td></tr><tr><td> Anti-Nkx6.1 </td><td> DSHB </td><td> F55A10 </td><td> Surnageant de culture cellulaire </td></tr><tr><td> Anti-p75 NTR </td><td> Abcam </td><td> Ab8874 </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 3. Table des réactifs spécifiques et les équipements.

lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons

Motoneurones spinaux évoluer vers les stades postmitotiques travers le développement précoce du système nerveux embryonnaire, et ensuite pousser les dendrites et les axones. Cellules neuroépithéliales du tube neural qui expriment Nkx6.1 sont les cellules précurseurs des motoneurones spinaux uniques 1. Bien motoneurones postmitotiques déplacer vers leur position finale et s&#39;organiser en colonnes le long du tractus épinière 2,3. Plus de 90% de l&#39;ensemble de ces motoneurones différenciées et positionné exprimer les facteurs de transcription Islet 1 / 2. Ils innervent les muscles des membres ainsi que ceux du corps et les organes internes. Entre autres, les motoneurones généralement expriment les récepteurs de haute affinité pour le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) et la neurotrophine-3 (NT-3), la tropomyosine liés kinase B et C (TrkB, TrkC). Ils n&#39;expriment pas la kinase tropomyosine liés A 4 (TrkA). Outre les deux récepteurs de haute affinité, les motoneurones expriment la faible affinité pour le récepteur neurotrophine p75 NTR. Le RNT p75 peut lier tous les neurotrophines avec une affinité similaire mais inférieur à toutes les neurotrophines que les récepteurs de haute affinité lierait les neurotrophines matures. Au sein de la moelle épinière embryonnaire, la RNT p75 est exclusivement exprimé par les motoneurones spinaux 5. Cela a été utilisé pour développer des techniques d&#39;isolement des motoneurones de purifier les cellules de la grande majorité des cellules environnantes 6. Motoneurones Isoler avec l&#39;aide d&#39;anticorps spécifiques (panning) contre les domaines extracellulaires de p75 NTR s&#39;est avéré être une méthode coûteuse que la quantité d&#39;anticorps utilisés pour une expérience unique est élevé en raison de la taille de la plaque utilisée pour le panoramique. Une alternative beaucoup plus économique est l&#39;utilisation de la lectine. Lectine a été démontré se lier spécifiquement à p75 NTR ainsi 7. La méthode suivante décrit une technique alternative utilisant agglutinine de germe de blé pour une procédure preplating au lieu de l&#39;anticorps p75 NTR. La lectine est une alternative très bon marché à l&#39;anticorps p75 NTR et les qualités de purification utilisant la lectine sont comparables à celle de l&#39;anticorps p75 NTR. Motoneurones de la moelle épinière embryonnaire peut être isolé par cette méthode, survivre et se développer hors des neurites.

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Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Une autre façon d&#39;isoler les motoneurones embryonnaires de souris à partir de la moelle épinière est décrite. La méthode prend en compte le fait que la lectine peuvent se lier au nerf affinité p75NTR bas du récepteur du facteur de croissance. Cette lectine preplating basé permet une purification similaire à celle d&#39;un anticorps spécifique contre le p75NTR.

Lectine à base d&#39;isolement et de la culture des motoneurones embryonnaires de la souris

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

lectin-based-isolation-and-culture-of-mouse-embryonic-motoneurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.9K vues.  Ruhr-University Bochum. Une autre façon d'isoler les motoneurones embryonnaires de souris à partir de la moelle épinière est décrite. La méthode prend en compte le fait que la lectine peuvent se lier au nerf affinité p75NTR bas du récepteur du facteur de croissance. Cette lectine preplating basé permet une purification similaire à celle d'un anticorps spécifique contre le p75NTR.

Vidéo: Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

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Neurosciences

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucléofection et de la culture primaire de neurones embryonnaires de souris hippocampe et cortex

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Établir embryonnaires de la souris culture de cellules souches neurales utilisant le test Neurosphère

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

Isolement et culture de cellules embryonnaires de rat neurones: un protocole rapide

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolement et culture de cellules de crêtes neurales de tube neural embryonnaire murin

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Dissection, de la culture, et de l&#39;analyse des<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tissus embryonnaires rétine

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Isolement et culture des astrocytes corticaux de souris

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Isolement et culture de cellules endothéliales de la embryonnaire du cerveau antérieur

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolement, Culture et maintenance à long terme des mésencéphalique primaire dopaminergiques neurones à partir de cerveaux embryonnaires de rongeurs

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Isolement et culture des adultes cellules souches neurales de la Subcallosal Zone Souris

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...