Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области гастроэнтерологии о влиянии членов микробиоты, в частности, рода Helicobacter, на воспаление и рак. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет изучать инфекцию геликобактеров и ее воздействие на желудок в физиологических условиях. Последствия этого метода распространяются на разработку методов лечения для профилактики или ликвидации инфекции Helicobacter или ее последствий, включая антибиотики, лекарства или вакцины.
Эти методы дают представление о патогенеза инфекции Helicobacter. Тем не менее, некоторые из методов могут быть адаптированы к изучению других желудочно-кишечных патогенов. Как правило, лица, новые для этого метода будет бороться с подготовкой бактериального инокулума, способного установить инфекцию у мышей.
Крайне важно, чтобы изоляты Helicobacter были известными штаммами колонизации мышей, которые не претерпели обширной субкультуры in vitro. Кроме того, следует фиксировали количество субкультур in vitro для этих штаммов. Добавьте бактериальные суспензии в 15-миллилитровые полистироловые трубки и используйте пластиковую петлю для переноса одной 10-20-микролитровой капли из каждой культуры на отдельные слайды стеклянного микроскопа.
Затем оцените жизнеспособность и подвижность бактерий в рамках фазово-контрастной микроскопии при 100-м увеличении. Используйте иокулу H.pylori только в том случае, если большинство бактерий имеют бациллярную форму. H.felis inocula должна в первую очередь содержать бактерии в форме helical.
И загрузите иокулу в отдельные одноразовые, одноми миллилитровые шприцы. Оборудуй каждый шприц иглой 23-го калибра и используйте пластиковую парафиновую пленку, чтобы прикрепить к каждой игле одноразовый полиэтиленовый катетер. Затем вручную сдерживайте шести-восьминедельную мышь без специфических патогенов и мышь без хеликобактеров за потертости шеи и хвоста и вставьте один катетер в центр открытой челюсти.
Руководство катетер в caudal к пищевода, расширение шеи мыши, чтобы облегчить доступ к желудку через пищевод и от трахеи, пока большинство или все катетер больше не видно и сопротивление ощущается. Затем доставить по крайней мере один раз от 10 до пятой бактерии для обеспечения оптимальной колонизации и патологии заболеваний. В конце эксперимента используйте тонкие изогнутые ножницы, чтобы открыть брюшную полость для иссечения желудка.
Вырезать желудок вдоль большей кривизны, и осторожно мыть орган два раза в одной 50-миллилитровой трубки свежего PBS за стирку, чтобы удалить остатки пищи. После второй стирки поместите ткань в смоляную шестисемейную пластиковую чашку Петри, чтобы зафиксировать мокрый вес. После уплощения желудка, разрезать образец sagittally на два равных фрагментов ткани, состоящей из antrum, тела и не-железистой области forestomach.
Удалите не железистой области, и весят половину каждого желудка перед хранением кусок ткани в соответствующем растворе для запланированного анализа вниз по течению. Добавьте другую половину ткани желудка в 15-миллилитровую коническую трубку, содержащую 10%формалин, уплощая ткани против верхних сторон труб через 10 секунд. Когда ткани прикрепится к стенкам трубки, повторно погрузите образцы в формалин, по крайней мере 24 часов.
Чтобы подсчитать количество жизнеспособных H.pylori в желудке после инфекции, гомогенизировать образцы желудка, хранящиеся в BHI, и выполнять дубликаты серийных разбавления в результате желудочных гомогенатов в свежем, стерильном бульоне. Разделите предварительно высушенный конский агар крови, или HBA, пластины, дополненные дополнительными антибиотиками, на три или четыре сегмента, и, используя адаптацию техники Майлза и Мисры, добавьте от 10 до 100 микролитров каждого желудка гомогенатного разбавления на сегмент каждой агарной пластины. Распространение гомогенатов с стерильными, пластиковые петли, и дайте пластины высохнуть.
Затем поместите пластины в перевернутое положение в анаэробные газовые банки, содержащие чашку воды Петри и газовую упаковку. Затем инкубировать банки при 37 градусах по Цельсию в течение четырех-семи дней. Когда колонии можно наблюдать, перечислите сегменты, содержащие от 10 до 100 изолированных колоний.
После эвтаназии желудок собирают у животных и взвешивают. Нехландулярная область удаляется, и желудок делится на две равные половинки, состоящие из антрума и тела. Успешная колонизация, как правило, подтверждается путем выполнения жизнеспособного подсчета и последующего перечисления отдельных колоний из желудочных гомогенатов, пронизанные на пластины HBA.
Обратите внимание, что наличие загрязняющих бактерий из мыши желудочной микробиоты или большое количество колоний H.pylori может осложнить перечисление H.pylori CFUs. Кроме того, ПЦР может быть использован для проверки инфекции с использованием конкретных проверенных грунтовок, направленных на 325-базовую парную область генов H.felis и H.pylori ureB. В этом репрезентативном эксперименте, дикий тип C57 Черный-6 мышей отображается умеренные признаки воспаления, в том числе гиперплазии и атрофии железы в шесть месяцев после заражения H.felis, а также клеточной инфильтрации субмукосы.
Более тяжелое воспаление наблюдается у нокаут мышей в то же время, с дополнительным присутствием лимфоидных фолликулов наблюдается в непосредственной близости от клеточных инфильтраций. Бактерии H.felis также могут быть визуализированы в окрашенных гимса участках инфицированной ткани желудка мыши. После этой процедуры, другие методы, такие как количественные ПЦР, иммуногистохимия, или иммунофторесценция могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы о типах принимающих ответов, вызванных во время инфекции Helicobacter.
После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области микробиологии и гастроэнтерологии, чтобы исследовать причинно-следственную роль Helicobacter pylori в болезни желудка у людей. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как воспроизвести заразить мышей с видами Helicobacter и изучить патологию, связанную с инфекцией. Не забывайте, что штаммы Helicobacter, используемые в этом протоколе, являются инфекционными, и поэтому стандартные процедуры биобезопасности всегда должны соблюдаться во время работы с этими бактериями.
