Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la gastroenterología sobre el impacto de los miembros de la microbiota, específicamente los del género Helicobacter, en la inflamación y el cáncer. La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio de la infección por Helicobacter y su impacto en el estómago en condiciones fisiológicas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el desarrollo de terapias para la prevención o eliminación de la infección por Helicobacter o sus consecuencias, incluyendo antibióticos, medicamentos o vacunas.
Estos métodos proporcionan información específica para la patogénesis de la infección por Helicobacter. Sin embargo, varias de las técnicas pueden adaptarse al estudio de otros patógenos gastrointestinales. Generalmente, individuos nuevos en este método lucharán con la preparación de un inóculo bacteriano capaz de establecer una infección en ratones.
Es imperativo que los aislados de Helicobacter sean cepas conocidas de colonización de ratón que no han sido sometidas a una extensa subcultura in vitro. Además, debe registrarse el número de subculturas in vitro para estas cepas. Agregue suspensiones bacterianas a tubos de poliestireno de 15 mililitros y utilice un bucle de plástico para transferir una gota de 10 a 20 microlitros de cada cultivo a diapositivas de microscopio de vidrio individuales.
A continuación, evalúe la viabilidad y la motilidad de las bacterias bajo microscopía de contraste de fase a un aumento de 100 veces. Utilice únicamente el H.pylori inocula si la mayoría de las bacterias tienen una forma bacilar. H.felis inocula debe contener principalmente bacterias en forma helicoidal.
Y cargue la inócula en jeringas individuales, desechables de un mililitro. Equipe cada jeringa con una aguja de calibre 23 y utilice una película de parafina de plástico para fijar un catéter de polietileno desechable a cada aguja. A continuación, retuvo manualmente un ratón libre de patógenos específicos de seis a ocho semanas de edad y sin helicobacter por el escrúpulo del cuello y la cola, e inserte un catéter en el centro de la mandíbula abierta.
Guiar el catéter en un caudal hacia el esófago, extendiendo el cuello del ratón para permitir la facilidad de acceso al estómago a través del esófago y lejos de la tráquea hasta que la mayor parte o todo el catéter ya no sea visible y se sienta una resistencia. Luego, entrega al menos una vez 10 a la quinta bacteria para asegurar una colonización óptima y patología de la enfermedad. Al final del experimento, usa tijeras finas y curvas para abrir la cavidad abdominal para la escisión del estómago.
Corte el estómago a lo largo de la mayor curvatura, y lave suavemente el órgano dos veces en un tubo de 50 mililitros de PBS fresco por lavado para eliminar cualquier alimento residual. Después del segundo lavado, coloque el tejido en una placa de plástico Petri de seis centímetros para registrar el peso húmedo. Después de aplanar el estómago, bisect la muestra sagittally en dos fragmentos de tejido igual que comprenden el antrum, cuerpo, y regiones de bosque no glandular.
Retire la región no glandular y pese la mitad de cada estómago antes de almacenar el trozo de tejido en la solución adecuada para el análisis descendente planificado. Agregue la otra mitad del tejido estomacal a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 10%formalina, aplanando los tejidos contra los lados superiores de los tubos después de 10 segundos. Cuando los tejidos se hayan colocado en las paredes del tubo, vuelva a sumergir las muestras en el formol durante al menos 24 horas.
Para contar el número de H.pylori viables en el estómago después de la infección, homogeneizar muestras de estómago almacenadas en BHI, y realizar diluciones en serie duplicadas de los homogeneatos gástricos resultantes en caldo fresco y estéril. Divida el agar de sangre de caballo preseleccionado, o HBA, las placas suplementadas con antibióticos adicionales en tres o cuatro segmentos, y, utilizando una adaptación de la técnica Miles y Misra, agregue de 10 a 100 microlitros de cada dilución homogeneizada estomacal en un segmento de cada placa de agar. Esparce los homogeneizas con bucles estériles de plástico y deja que las placas se sequen.
A continuación, coloque las placas en una posición invertida en frascos de gas anaerobe que contengan un plato de agua Petri y un paquete de gas. Luego, incuba los frascos a 37 grados centígrados durante cuatro a siete días. Cuando se pueden observar colonias, enumere los segmentos que contienen entre 10 y 100 colonias aisladas.
Después de la eutanasia, el estómago se cosecha de los animales y se pesa. Se extirpa la región no glandular, y el estómago se divide en dos mitades iguales que comprenden el antrum y el cuerpo. La colonización exitosa se confirma típicamente mediante la realización de un conteo viable y la posterior enumeración de colonias individuales de homogeneizaciones gástricas rayadas en placas de HBA.
Tenga en cuenta que la presencia de bacterias contaminantes de la microbiota gástrica del ratón o un gran número de colonias de H.pylori puede complicar la enumeración de las UFC H.pylori. Alternativamente, se puede emplear pcR para verificar la infección utilizando imprimaciones validadas específicas dirigidas a una región de par de 325 bases de los genes H.felis y H.pylori ureB. En este experimento representativo, los ratones C57 Black-6 de tipo salvaje mostraron signos moderados de inflamación, incluyendo hiperplasia y atrofia de la glándula a los seis meses después de la infección con H.felis, así como la infiltración celular de la submucosa.
Se observa una inflamación más grave en ratones knockout al mismo tiempo, con la presencia adicional de folículos linfoides observada cerca de los infiltrados celulares. Las bacterias H.felis también se pueden visualizar en secciones teñidas de Giemsa del tejido estomacal del ratón infectado. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la PCR cuantitativa, la inmunohistoquímica o la inmunofluorescencia para responder preguntas adicionales sobre los tipos de respuestas del huésped inducidas durante la infección por Helicobacter.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la microbiología y la gastroenterología exploraran el papel causal de Helicobacter pylori en la enfermedad estomacal en los seres humanos. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo infectar reproduciblemente ratones con especies de Helicobacter y para estudiar la patología asociada con la infección. No olvide que las cepas de Helicobacter utilizadas en este protocolo son infecciosas, y por lo tanto los procedimientos estándar de bioseguridad siempre deben seguirse mientras se trabaja con estas bacterias.
