Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la gastroentérologie sur l’impact des membres du microbiote, en particulier ceux du genre Helicobacter, sur l’inflammation et le cancer. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’étude de l’infection à Helicobacter et de son impact sur l’estomac dans des conditions physiologiques. Les implications de cette technique s’étendent vers le développement de thérapies pour la prévention ou l’élimination de l’infection à Helicobacter ou de ses conséquences, y compris les antibiotiques, les médicaments ou les vaccins.
Ces méthodes fournissent un aperçu spécifique à la pathogénie de l’infection à Helicobacter. Cependant, plusieurs des techniques peuvent être adaptées à l’étude d’autres pathogènes gastro-intestinaux. En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal avec la préparation d’un inoculum bactérien capable d’établir une infection chez la souris.
Il est impératif que les isolats d’Helicobacter soient des souches connues de colonisation de souris qui n’ont pas subi de sous-culture étendue in vitro. En outre, le nombre de sous-cultures in vitro pour ces souches doit être enregistré. Ajoutez des suspensions bactériennes aux tubes de polystyrène de 15 millilitres et utilisez une boucle en plastique pour transférer une gouttelette de 10 à 20 microlitres de chaque culture sur des diapositives individuelles au microscope en verre.
Ensuite, évaluez la viabilité et la motilité des bactéries sous microscopie à contraste phase à un grossissement 100 fois. N’utilisez l’inocula H.pylori que si la majorité des bactéries ont une forme bacillaire. H.felis inocula doit principalement contenir des bactéries en forme d’hélicoïque.
Et chargez l’inocula dans des seringues individuelles, jetables et d’un millilitre. Équipez chaque seringue d’une aiguille de calibre 23 et utilisez un film en plastique paraffine pour fixer un cathéter de polyéthylène jetable à chaque aiguille. Ensuite, retenez manuellement une souris sans pathogène spécifique et sans helicobacter de six à huit semaines par le scruff du cou et de la queue, et insérez un cathéter au centre de la mâchoire ouverte.
Guider le cathéter dans un caudale vers l’œsophage, en étendant le cou de la souris pour permettre une facilité d’accès à l’estomac par l’œsophage et loin de la trachée jusqu’à ce que la majeure partie ou la majeure partie du cathéter ne soit plus visible et qu’une résistance se fait sentir. Ensuite, livrer au moins une fois 10 à la cinquième bactérie pour assurer une colonisation optimale et la pathologie de la maladie. À la fin de l’expérience, utilisez des ciseaux fins et incurvés pour ouvrir la cavité abdominale pour l’excision de l’estomac.
Couper l’estomac le long de la courbure plus grande, et laver doucement l’organe deux fois dans un tube de 50 millilitres de PBS frais par lavage pour enlever tous les aliments résiduels. Après le deuxième lavage, placez le tissu dans une boîte de Pétri en plastique goudronnée de six centimètres pour enregistrer le poids humide. Après avoir aplati l’estomac, couper l’échantillon en deux fragments de tissus égaux comprenant les régions de l’antrum, du corps et de la forêt non glandulaire.
Retirez la région non glandulaire et pesez la moitié de chaque estomac avant de stocker le morceau de tissu dans la solution appropriée pour l’analyse prévue en aval. Ajouter l’autre moitié du tissu gastrique à un tube conique de 15 millilitres contenant 10% de formaline, aplatissant les tissus contre les côtés supérieur des tubes après 10 secondes. Lorsque les tissus sont fixés aux parois du tube, immerger les échantillons dans la formaline pendant au moins 24 heures.
Pour compter le nombre de H.pylori viables dans l’estomac après l’infection, homogénéisez les échantillons d’estomac stockés dans BHI, et effectuez des dilutions périodiques dupliquées des homogénéités gastriques résultantes dans le bouillon frais et stérile. Divisez l’agar de sang de cheval pré-séché, ou HBA, plaques complétées par des antibiotiques supplémentaires en trois ou quatre segments, et, en utilisant une adaptation de la technique Miles et Misra, ajouter 10 à 100 microlitres de chaque dilution homogénéisé de l’estomac sur un segment de chaque plaque d’agar. Étendre les homogénéités avec des boucles stériles en plastique et laisser sécher les plaques.
Ensuite, placez les assiettes en position inversée dans des pots de gaz anaéroobe contenant une boîte d’eau Petri et un paquet de gaz. Ensuite, incubez les pots à 37 degrés Celsius pendant quatre à sept jours. Lorsque des colonies peuvent être observées, énumérer les segments contenant entre 10 et 100 colonies isolées.
Après l’euthanasie, l’estomac est récolté chez les animaux et pesé. La région non glandulaire est enlevée, et l’estomac est divisé en deux moitiés égales comprenant l’antrum et le corps. La colonisation réussie est généralement confirmée en effectuant un comptage viable et l’énumération subséquente de colonies individuelles à partir d’homogénéités gastriques striées sur des plaques HBA.
Notez que la présence de bactéries contaminantes provenant du microbiote gastrique de la souris ou d’un grand nombre de colonies de H.pylori peut compliquer l’énumération des FC H.pylori. Alternativement, pcr peut être employé pour vérifier l’infection utilisant des amorces validées spécifiques dirigées à une région de paire de 325-base des gènes H.felis et H.pylori ureB. Dans cette expérience représentative, les souris noires-6 de type sauvage de type sauvage ont montré des signes modérés d’inflammation, y compris l’hyperplasie et l’atrophie de glande à six mois après infection avec H.felis, aussi bien que l’infiltration cellulaire du submucosa.
Une inflammation plus grave est observée chez les souris knock-out au même moment, avec la présence supplémentaire de follicules lymphoïdes observés à proximité des infiltrations cellulaires. Les bactéries H.felis peuvent également être visualisées dans les sections tachées de Giemsa du tissu de l’estomac de souris infecté. Après cette procédure, d’autres méthodes comme le PCR quantitatif, l’immunohistochimie ou l’immunofluorescence peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur les types de réponses de l’hôte induites lors de l’infection à Helicobacter.
Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la microbiologie et de la gastroentérologie pour explorer le rôle causal de Helicobacter pylori dans les maladies de l’estomac chez l’homme. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’infecter reproductiblement les souris avec des espèces d’Helicobacter et d’étudier la pathologie associée à l’infection. N’oubliez pas que les souches Helicobacter utilisées dans ce protocole sont infectieuses, et donc les procédures standard de biosécurité doivent toujours être suivies tout en travaillant avec ces bactéries.
