תרבית תאים חיידקיים ברמה תא בודד בתוך שלפוחיות ענק

פרוטוקול זה מספק אמצעי לפולחן תאים חיידקיים ברמת התא הבודד בתוך וריים ענקיים. קל לפתח את הויקטים הענקיים, ורק נפח קטן מאוד של פתרון מדגם נדרש כדי להכין את הווסיקים. הדגמת ההליך תהיה יורי אוטה, מועמד לדוקטורט מהמעבדה שלנו.

התחל על ידי הוספת 20 microliters של פתרון POPC מוכן טרי וארבעה microliters של פתרון ביוטין-PEG-DSPE מוכן טרי לבקבוקון זכוכית. להתאדות את הממס האורגני על ידי זרימת אוויר עד סרט השומנים נוצר. מניחים את הסרט ב desiccator במשך שעה אחת כדי להתאדות לחלוטין את הממס האורגני.

לאחר מכן מוסיפים 200 מיקרוליטרים של שמן מינרלי לבקבוקון. מכסים את פתיחת הבקבוקון עם סרט פרפין פלסטיק, ו sonicate את תכולת הבקבוקון באמבטיה קולית ב 120 וואט לפחות שעה אחת. להכנת קבוצה קטנה, ליצור סרט השומנים, כפי שהוכח רק, ולהוסיף 200 microliters של 200 מילימטר גלוקוז במדיום LB לסרט.

לאחר מכן sonicate הסרט ב 120 וואט לפחות שעה, ואחריו הבלטה של שלפוחיות ענק וכתוצאה מכך לתוך שלפוחיות קטנות באמצעות extruder מיני קרום פוליקרבונט עם גודל נקבובית 100 ננומטר. עבור תא חיידקי טרום תרבות, לחסן E.coli מצלחת LB למיליליטרים של מדיום LB לתרבות לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, להעביר 20 microliters של העל-טבעי של התרבות ל 1.98 מיליליטר של מדיום LB טרי עבור שעתיים נוספות של תרבות.

בסוף הדגירה, בדוק את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר, או OD 600 ערך, של פתרון טרום תרבות על ספקטרופוטומטר. יש להשתמש בפתרון טרום-תרבותי עם OD 600 של אחד עד 1.5. לאחר מכן מערבבים את הפתרון טרום תרבות עם פתרון סוכרוז מוכן טרי בינוני LB טרי, על פי שולחן אחד.

להיווצרות וריסקים ענקיים, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של פתרון מימי טרי של וריסקים ענקיים לצינור פלסטיק מרופד 1.5 מיליליטר. בעדינות שכבה 150 microliters של תותבת שמן המכיל שומנים מעל הפתרון הממימי החיצוני של יידים ענקיים. הדגירה את הפתרון וכתוצאה מכך במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר, לפני הבדיקה כדי להבטיח כי הממשק של השמן ופתרונות מים הוא שטוח.

לתא חיידקי מים ושמן המכיל היווצרות טיפות, הוסיפו שני מיקרוליטרים של פתרון מימי פנימי שהוכן טרי של ורידים ענקיים ל-50 מיקרוליטרים של תותבת השמן המכילה שומנים מחוסנים בצינור פלסטיק שטוף 0.6 מיליליטר. לאחר מכן, הקש על הצינור כדי לחקות את שני הרכיבים. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה כדי להוסיף 50 מיקרוליטרים של תותב טיפות מים ושמן לממשק של השמן והתסיסה המים, ולמשחות את ורידים ענקיים המכילים תאים חיידקיים על ידי צנטריפוגה.

לאחר מכן שאפו את שכבת השמן העליונה ואספו את הווסיקים הענקיים. כדי להכין תא בעבודת יד, לקדוח חור שבעה מילימטר עם אגרוף חלול על 10 על ידי 10 על ידי חותם כפול פנים מילימטר אחד, ולאחר מכן להדביק את החותם דו פנים על 30 על ידי 40 מילימטר כיסוי זכוכית. להכנת קרום דו שכבתי נתמך, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של תותב הווסקל הקטן לחור של התא בעבודת יד.

הדגירה את הווסיקים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. בסוף הדגירה, בעדינות לשטוף את החור פעמיים עם 20 microliters של בינוני LB, בתוספת 200 מילימילר גלוקוז. כדי לשתק ורידים ענקיים על קרום דו שכבתי תומך, להציג 10 microliters של neutravidin בתווית ורידים ענקית מים החיצוני לחור עבור דגירה 15 דקות בטמפרטורת החדר.

בסוף הדגירה, לשטוף בעדינות את החור פעמיים עם 20 microliters של בינוני LB, בתוספת 200 מילימילר גלוקוז, ולהוסיף את כל נפח של פתרון וריסק ענק לחור בתא. ואז לאטום את החור עם 18 על 18 מילימטר כיסוי זכוכית. כדי לנטר את צמיחת החיידקים בתוך וקסיקים ענקיים, בחר את המטרה 40X על מיקרוסקופ הפוך, והצב את התא על מערכת שלב חימום מיקרוסקופ.

לאחר מכן הדגירה את ורי ענק המכיל תא חיידקי בתא בתנאים סטטיים במשך שש שעות ב 37 מעלות צלזיוס, לכידת והקלטה תמונות של צמיחת תא חיידקי כל 30 דקות, עם המצלמה המדעית משלימה תחמוצת מתכת מוליכים למחצה. וריסקים ענקיים המכילים תאים חיידקיים נעים בדרך כלל בין 10 ל -30 מיקרומטר. עבור שני הגדלים של גירויים ענקיים, תאי ה- E.coli עוברים תהליכי התארכות וחלוקה, כאשר כמה תאי E.coli גדלים למספר גדול מאוד של תאים במהלך תקופת התצפית של שש שעות.

התדירות היחסית של זרעי ענק המכילים רמת תא יחיד היא כ-10% מהוווסתים הענקיים המתקבלים, והווסיקלס הענקיים המובלים ברמת התא הבודד הם כ-50% מהוויים הענקיים המכילים תאי חיידקים. היציבות של ממשק מי השמן חשובה להשגת ערכות ענק המכילות תאי חיידקים. יש לדאוג שאפו את השמן בזהירות לפני תיקון וריד ענק.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לתרבת תאים חיידקיים ברמת התא הבודד בתוך וריים ענקיים בודדים. שיטת התרבות החיידקית שלנו היא כלי חדש במיקרוביולוגיה לגידול חיידקים סביבתיים לא ידועים כדי להשיג או לנתח את המוצרים המטבוליים שלהם.