Questo protocollo fornisce un mezzo per coltivare cellule batteriche a livello di una singola cellula all'interno di vescicole giganti. È facile sviluppare le vescicole giganti e per preparare le vescicole è necessario solo un volume molto piccolo di soluzione campione. A dimostrare la procedura sarà Yuri Ota, dottorando del nostro laboratorio.
Inizia aggiungendo 20 microlitri di soluzione POPC appena preparata e quattro microlitri di soluzione biotina-PEG-DSPE appena preparata a una fiala di vetro. Evaporare il solvente organico per flusso d'aria fino a formare un film lipidico. Mettere il film in un essiccatore per un'ora per evaporare completamente il solvente organico.
Quindi aggiungere 200 microlitri di olio minerale al flaconcino. Coprire l'apertura del flaconcino con pellicola di paraffina di plastica e sonicare il contenuto del flaconcino in un bagno ad ultrasuoni a 120 watt per almeno un'ora. Per una piccola preparazione di vescicola, creare un film lipidico, come appena dimostrato, e aggiungere 200 microlitri di glucosio di 200 millimetri nel mezzo LB al film.
Quindi sonicare il film a 120 watt per almeno un'ora, seguito dall'estrusione delle vescicole giganti risultanti in piccole vescicole usando un mini estrusore e una membrana in policarbonato con una dimensione dei pori di 100 nanometri. Per la precoltura delle cellule batteriche, inoculare E.coli da una piastra LB in millilitri di mezzo LB per una coltura notturna a 37 gradi Celsius. La mattina seguente, trasferire 20 microlitri del supernatante della coltura a 1,98 millilitri di mezzo LB fresco per altre due ore di coltura.
Al termine dell'incubazione, controllare la densità ottica a 600 nanometri, o valore OD 600, della soluzione pre-coltura su uno spettrofotometro. Deve essere utilizzata una soluzione pre-coltura con OD 600 da uno a 1,5. Quindi mescolare la soluzione pre-coltura con soluzione di saccarosio preparata al momento e mezzo LB fresco, secondo la tabella uno.
Per la formazione di vescicole giganti, aggiungere 50 microlitri di una soluzione acquosa esterna preparata al momento di vescicole giganti a un tubo di plastica lidded da 1,5 millilitri. Strato delicato 150 microlitri della soluzione di olio contenente lipidi sulla soluzione acquosa esterna di vescicole giganti. Incubare la soluzione risultante per 10-15 minuti a temperatura ambiente, prima di verificare che l'interfaccia dell'olio e delle soluzioni acquose sia piatta.
Per le cellule batteriche dell'acqua e dell'olio contenenti formazione di goccioline, aggiungere due microlitri di una soluzione acquosa interna appena preparata di vescicole giganti a 50 microlitri della soluzione di olio sonicato contenente lipidi in un tubo di plastica lidded da 0,6 millilitri. Quindi, toccare il tubo per emulsionare i due componenti. Successivamente, utilizzare una pipetta per aggiungere 50 microlitri di acqua e soluzione di goccioline di olio all'interfaccia dell'olio e della soluzione acquosa e sedimentare le vescicole giganti contenenti cellule batteriche mediante centrifugazione.
Quindi aspirare lo strato superiore di olio e raccogliere le vescicole giganti. Per preparare una camera fatta a mano, praticare un foro di sette millimetri con un punzone cavo su una guarnizione a doppia faccia da 10 per 10 per un millimetro, quindi incollare la guarnizione a doppia faccia su un vetro di copertura da 30 per 40 millimetri. Per preparare una membrana bistrato supportata, aggiungere 30 microlitri della piccola soluzione di vescicola al foro della camera fatta a mano.
Incubare le vescicole a temperatura ambiente per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare delicatamente il foro due volte con 20 microlitri di mezzo LB, integrati con glucosio da 200 millimiller. Per immobilizzare vescicole giganti sulla membrana bistrato del sostenitore, introdurre 10 microlitri di neutravidina nella soluzione di vescicola gigante acquosa esterna al foro per un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, lavare delicatamente il foro due volte con 20 microlitri di mezzo LB, integrati con glucosio da 200 millimiller, e aggiungere l'intero volume di soluzione vescicolare gigante al foro nella camera. Quindi sigillare il foro con un vetro di copertura da 18 a 18 millimetri. Per monitorare la crescita batterica all'interno delle vescicole giganti, selezionare l'obiettivo 40X su un microscopio invertito e posizionare la camera sul sistema di stadio di riscaldamento del microscopio.
Quindi incubare le vescicole giganti contenenti cellule batteriche nella camera in condizioni statiche per sei ore a 37 gradi Celsius, catturando e registrando immagini della crescita delle cellule batteriche ogni 30 minuti, con la telecamera scientifica complementare a semiconduttore di ossido di metallo. Le vescicole giganti contenenti cellule batteriche in genere variano da 10 a 30 micrometri. Per entrambe le dimensioni delle vescicole giganti, le cellule E.coli subiscono processi di allungamento e divisione, con alcune cellule E.coli che crescono fino a raggiungere un numero molto elevato di cellule durante il periodo di osservazione di sei ore.
La frequenza relativa delle vescicole giganti contenenti un singolo livello cellulare è circa il 10% delle vescicole giganti ottenute, e le vescicole giganti incapsulate a livello di singola cellula sono circa il 50% delle vescicole giganti contenenti cellule batteriche. La stabilità dell'interfaccia olio-acqua è importante per ottenere vescicole giganti contenenti cellule batteriche. Fare attenzione ad aspirare l'olio con attenzione prima della correzione gigante della vescicola.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltura delle cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di singole vescicole giganti. Il nostro metodo di coltura batterica è un nuovo strumento in microbiologia per coltivare batteri ambientali sconosciuti per ottenere o analizzare i loro prodotti metabolici.
