Bu protokol, dev veziküllerin içindeki tek hücreli seviyede bakteri hücrelerinin kültüre sayılmaması için bir araç sağlar. Dev vezikülleri geliştirmek kolaydır ve vezikülleri hazırlamak için çok küçük bir numune çözeltisi gereklidir. Prosedürü gösteren Yuri Ota, bizim laboratuvar bir doktora adayı olacaktır.
Bir cam şişeye 20 mikrolitre taze hazırlanmış POPC çözeltisi ve dört mikrolitre taze hazırlanmış biotin-PEG-DSPE çözeltisi ekleyerek başlayın. Bir lipid film oluşana kadar hava akımı ile organik çözücü buharlaştırmak. Tamamen organik çözücü buharlaştırmak için bir saat için bir kurutucu film yerleştirin.
Sonra şişeye 200 mikrolitre mineral yağ ekleyin. Plastik parafin film ile şişe nin açılış kapağı ve en az bir saat boyunca 120 watt bir ultrasonik banyoda şişe içeriğini sonicate. Küçük bir vezikül hazırlığı için, bir lipid film oluşturmak, sadece gösterildiği gibi, ve filme LB orta 200 milimetre lik glikoz 200 mikrolitre ekleyin.
Daha sonra filmi en az bir saat boyunca 120 watt'ta sonicate, ardından ortaya çıkan dev veziküllerin mini ekstrüzyon ve 100 nanometre lik gözenek boyutuna sahip polikarbonat membran kullanarak küçük veziküllere ekstrüzyonu. Bakteri hücresi öncesi kültür için, 37 santigrat derece bir gecede kültür için LB orta mililitre içine bir LB plaka E.coli aşılamak. Ertesi sabah, kültürün süpernatant 20 mikrolitre aktarın 1.98 taze LB orta ek iki saat için.
Kuluçka sonunda, optik yoğunluğu nu spektrofotometredeki kültür öncesi çözeltinin 600 nanometre veya OD 600 değerinde kontrol edin. 1 ile 1,5 arasında OD 600 ile kültür öncesi çözüm kullanılmalıdır. Daha sonra birinci masaya göre, kültür öncesi solüsyonu taze hazırlanmış sakaroz solüsyonu ve taze LB ortamı ile karıştırın.
Dev vezikül oluşumu için, 1,5 mililitre kapaklı plastik tüp için dev veziküllerin taze hazırlanmış dış sulu çözelti50 mikrolitre ekleyin. Yavaşça dev veziküllerin dış sulu çözeltisi üzerinde lipid içeren yağ çözeltisi 150 mikrolitre katman. Yağ ve sulu çözeltilerin arabiriminin düz olduğundan emin olmak için kontrol etmeden önce, ortaya çıkan çözeltiyi oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika kuluçkaya yatırın.
Damlacık oluşumu içeren su ve yağ bakteri hücresi için, 0,6 mililitrelik kapaklı plastik tüpte sonicated lipid içeren yağ çözeltisinin 50 mikrolitresine, dev veziküllerin taze hazırlanmış iç sulu çözeltisinin iki mikrolitresini ekleyin. Ardından, iki bileşeni emülgatörlük için tüpe dokunun. Daha sonra, yağ ve sulu çözelti arayüzüne 50 mikrolitre su ve yağ damlacık çözeltisi eklemek için bir pipet kullanın ve santrifüj ile bakteri hücresi içeren dev vezikülleri tortulayın.
Sonra üst yağ tabakası aspire ve dev veziküller toplamak. El yapımı bir hazne hazırlamak için, 10'a 10'a 10'luk çift yüzlü bir mührü delin ve çift yüzlü mührü 30'a 40 milimetrelik kapak camı üzerine yapıştırın. Desteklenen bir iki katmanlı membran hazırlamak için, el yapımı oda deliğine küçük vezikül çözeltisi 30 mikrolitre ekleyin.
Vezikülleri oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, 200 milimiller glikoz ile desteklenen 20 mikrolitre LB orta ile deliği iki kez hafifçe yıkayın. Destekçi iki katmanlı membran üzerinde dev veziküller hareketsizleştirmek için, oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka için deliğe dış sulu dev vezikül çözeltisi neutravidin 10 mikrolitre tanıtmak.
Kuluçka sonunda, yavaşça LB orta 20 mikrolitre ile iki kez delik yıkayın, 200 milimiller glikoz ile takviye, ve odasında deliğe dev vezikül çözeltisi tüm hacmi ekleyin. Sonra 18 tarafından 18 milimetrelik kapak camı ile delik mühür. Dev veziküller içindeki bakteri üremesini izlemek için ters mikroskoptaki 40X hedefini seçin ve odayı mikroskop ısıtma sahne sistemine yerleştirin.
Daha sonra 37 santigrat derece statik koşullar altında oda içinde bakteri hücre içeren dev veziküller kuluçka, yakalama ve her 30 dakikada bir bakteri hücre büyüme görüntüleri kayıt, bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarı iletken kamera ile. Bakteri hücreleri içeren dev veziküllerin boyutları genellikle 10 ila 30 mikrometre arasında değişir. Dev veziküllerin her iki boyutu için, E.coli hücreleri uzama ve bölünme süreçlerinden geçer, bazı E.coli hücreleri altı saatlik gözlem süresi boyunca çok sayıda hücreye büyürler.
Tek hücre lisenini içeren dev veziküllerin göreceli sıklığı elde edilen dev veziküllerin yaklaşık %10'udur ve tek hücre düzeyinde kapsüllenmiş dev veziküller bakteri hücreleri içeren dev veziküllerin yaklaşık %50'sikadardır. Yağ-su arabiriminin stabilitesi bakteri hücreleri içeren dev veziküller elde etmek için önemlidir. Dev vezikül düzeltme önce dikkatle yağ aspire dikkat edin.
Bu videoyu izledikten sonra, tek tek dev veziküller içinde tek hücre düzeyinde bakteri hücreleri kültür nasıl iyi bir anlayışa sahip olmalıdır. Bakteri kültürü yöntemimiz, mikrobiyolojide bilinmeyen çevresel bakterilerin metabolik ürünlerini elde etmek veya analiz etmek için yeni bir araçtır.
