في هذا الاستعراض، سوف نناقش كل من التصوير والتقنيات الكيميائية الحيوية المستخدمة لدراسة تحديد المواقع التركيبية والتركيب، فضلا عن إعادة ترتيب الهيكل السيتوسلتون لوحظت أثناء تشكيل المشبك المناعي. المراحل الأولية لإعادة عرض نشطة تسمح الخلايا B لزيادة سطح الخلية وتعظيم كمية مجمعات BCR مستضد تجمع في المشبك. من ناحية أخرى ، يمكن أن يقترن التوظيف المحلي للليسوسومات ، جنبا إلى جنب مع سنتروسوم في الغشاء المتشابك ، إلى إفراز الليسوسوم ، الذي من المعروف أنه يسهل استخراج المستضدات المُشلّة.
يتم معالجة مستضد Uptaken كذلك داخل مقصورات endolysosome في الببتيدات ، والتي يتم تحميلها على جزيئات MHC من الفئة II لعرضها على الخلايا المساعدة T. لذلك، دراسة ديناميات العضية المرتبطة المشبك المناعي أمر بالغ الأهمية لفهم كيفية تنشيط الخلايا B بشكل كامل. المناعة الخلايا B تنشيط مع مستضدات شلت يسمح لنا لمتابعة مكونات الخلايا المختلفة وكيف يمكن تجنيدهم إلى المشبك المناعي.
يمكن تنشيط الخلايا ب من خلال مستضدات مُشلّلة على سطح خرزة أو سطح غطاء. يتم إعداد الخرز المغلفة بالمستضدات عن طريق احتضان يغاندس محددة مع الخرز الأميني تعامل سابقا مع الجلوتارالديهيد لتنشيط المجموعات الأمينية. Resuspend تنشيط الخرز في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني ودوامة.
وفي الوقت نفسه، إعداد حل مستضد بإضافة 100 ميكروغرام لكل مل من BCR ligand في 150 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. بعد ذلك، أضف 50 ميكرولترات من الخرز المنشط إلى محلول المستضد واحتضانه بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. تذكر، أيضا استخدام ليغاند لا علاقة لها كتحكم سلبي.
بعد الحضانة، وغسل الخرز مع برنامج تلفزيوني. استلهم المابير واستبدالها بـ PBS. كرر ثلاث مرات.
المقبل، كتلة المجموعات الأمينية الثلاث من قبل حبات resuspended في 500 ميكرولترات من حل من BSA. وأخيرا ، حبات resuspend في 70 ميكروليترس من برنامج تلفزيوني. لحساب التركيز النهائي، يمكنك استخدام مقياس الهيموسيتات لحساب الخرز.
لتفعيل الخلية B، استخدم أنبوب 50 مل والخلايا resuspend إلى تركيز 1.5 مليون لكل مل في انقر تكملها مع 5٪ مصل الأبقار الجنين. بعد ذلك، إضافة 150، 000 B الخلايا، المقابلة ل100 ميكرولترات من خليط حبة الخلية إلى بولي-L-lysine المغلفة يغطي العازل ad حضى في 37 درجة لنقاط زمنية مختلفة. وهناك نهج ثان لتنشيط الخلايا B هو بذر لهم على الأغطية المغلفة مستضد.
لهذا الغرض، الشرائح معطف مع مكافحة BCR وB220 مع يحسن التصاق الخلية. إعداد محلول المستضد عن طريق إضافة المضادة BRC و B220 في برنامج تلفزيوني إلى تركيز نهائي من 10 ميكروغرام لكل مل و 0.5 ميكروغرام لكل مل، على التوالي. المقبل، تعيين coverslip على غطاء من 24 لوحة جيدا مغطاة فيلم بارا فيلم وإضافة 40 ميكروليتر من محلول المستضد.
ختم لوحة ومن ثم احتضان في 4 درجات بين عشية وضحاها. لبدء التنشيط في coverlip ، قم بغسلها أولاً باستخدام برنامج تلفزيوني والسماح لهم بالجفاف لبضع دقائق. بعد ذلك، إضافة 150، 000 B الخلايا واحتضان في 37 درجة لنقاط زمنية مختلفة.
في كلتا الحالتين، عند تفعيل إما مع الخرز أو الشرائح المغلفة مستضد، نوصي بدءا من أطول نقطة زمنية ومن ثم الانتقال إلى أقصر منها. بمجرد أن تكون قد شنت غطاء الجافة على شريحة المجهر، يمكنك استخدام epifluorescence أو مجهر confocal لعرض العينات الخاصة بك، اعتمادا على متطلبات القرار. التركيز على العينة باستخدام الضوء المنقولة.
يجب عليك البحث عن الحقول التي تتفاعل فيها الخلايا والخرز بمعدل واحد. بالنسبة للخلايا B التي يتم تنشيطها على الأغطية المغطاة بمضادات، استخدم هدف 100x للحصول على دقة أفضل. بالنسبة للمعلمات، خذ رزمة z التي تغطي الخلية بأكملها.
يمكنك تسمية actin لتحديد الحدود السفلية والعليا من الخلية. بالنسبة لخلايا B التي يتم تنشيطها باستخدام الخرز المغلف بالمضادات وتسميتها للعضيات المحصورة في نقطة واحدة، أولاً تحديد منطقتين: منطقة الخلية ومنطقة الخرزة. بعد ذلك، حدد الموضع أو العضية بواسطة نقطة والحصول على إحداثياتها المحلية.
رسم اثنين من ناقلات: واحد بين مركز الخلية و organelle، والآخر بين مركز الخلية ومركز الخرزة. قياس طول كل من وقياس الزاوية بين ناقلين، يشار إليها الآن باسم ألفا. جعل الإسقاط مع الناقل بين مركز ومركز الخلية باستخدام غواسيان ألفا ومن ثم حساب مؤشر قطبية من organelle عن طريق تقسيم ناقلات المتوقعة، أ، على ب.
لذلك يشير فهرس قطبيّة بين صفر وواحدة نوع ظاهريّة مستقطبة. تشير القيم بين صفر وناقص واحد إلى نوع ظاهري غير مستقطب. من أجل تحديد مؤشر قطبية لعضيات أكثر تشتتا، مثل الليسوسومات، يمكنك استخدام نفس الخوارزمية المذكورة من قبل، وتغيير إحداثيات توطين organelle لإحداثيات مركز الكتلة من التسميات، في هذه الحالة، lysosomes.
وعلى غرار التحليل الذي سبق وصفه، يشير مؤشر الاستقطاب بين الصفر والأخرى إلى نمط ظاهري مستقطب، في حين أن القيم بين الصفر وناقصة تشير إلى نمط ظاهري غير مستقطب. لتحديد كمية كل عضو معين عن كثب إلى المشبك الجديد ، يمكنك حساب النسبة المئوية للفلوريسينل العضية في الخرزة. لهذا، يجب تحديد منطقة الخرزة والخلية، وقياس كثافة الفلورسنس المعنية ومن ثم تقسيم الفلورسينس حبة من قبل مجموع من الخرزة وفلوريسنس الخلية.
سوف تحصل على كمية كل organelle التي هي في اتصال مع المشبك الجديد. بدلا من ذلك، رسم مستطيل عكس حبة. استخدام الوزن المقابل لربع طول الخلية، ثم قياس كثافة الفلوريسنس داخل المستطيل وتقسيمه على الفلورا مجموع.
هذه الخوارزمية سوف دائماً الحصول على النسبة المئوية من organelle التي هي قريبة إلى المشبك الجديد، ولكن ليس بالضرورة في اتصال مباشر مع واجهة. لتحديد كمي المكونات المرتبطة المركزية في الخلايا باء يستريح وتنشيطها. باختصار، نحدد ثلاث معلمات.
الخلية و منطقة الخرز، وإحداثيات الإحداثيات المركزية. بعد ذلك، نحدد دائرة تحيط بالمركز ونجري تحليلًا شعاعيًا للملف الشخصي من وسط المركز، المحدد مسبقًا. بمجرد أن يكون لديك المؤامرة، وتحديد نصف القطر الذي يتم الحفاظ على 70٪ من الفلوريس الحد الأقصى.
استخدم هذا النطاق لرسم دائرة تحيط بالوست. وأخيراً، احصل على كثافة الفلورسنت لعنصر الفائدة في منطقة المركز ومنطقة الخلية، وقسّم القيمتين للحصول على نسبة كثافة الفلورسنت. لقياس توزيع العضيات في واجهة المناهج المناعية، حدد أولاً منطقة الخلايا B في اتصال مع غطاء المغطى المغطى بالمستضد.
يمكنك تسمية actin لمساعدتك في تحديد هذه المنطقة. بعد ذلك، قم بقياس المنطقة المتلامسة مع الشريحة والارتفاع وعرض الخلية. المنطقة التي تواجه زلة الغطاء المغلفة بالمستضد هي قياس الخلية B تنتشر عند تنشيط الخلية B.
استخدم قيم الطول والعرض لتحديد منطقة مركزية في الخلية، والتي يتم فصلها عن الحدود بمقدار ربع الارتفاع وقيم العرض. عادة ما تكون هذه تتوافق مع ما يقرب من ثلث مساحة الخلية الإجمالية. وأخيراً، حساب التوظيف العضية في مركز المشبك الجديد، وتقسيم كثافة الفلوريسين في المنطقة المركزية حسب كثافة الفلورس من الخلية بأكملها.
تشير القيم الموجبة لهذا الفهرس إلى إثراء العضية في مركز المشبك الجديد. على العكس من ذلك، تشير القيم السالبة إلى توزيع محيطي. لقياس توزيع العضيات عبر المقاييس z من الخلايا B المنشطة على الأغطية المغلفة مستضد، أولاً تحديد واجهة متشابك والحد الأعلى للخلية.
بعد ذلك، رسم خط عبر مركز الخلية وإعادة الصورة للحصول على صورة XZ. قياس رئيس الخلية وتقسيم الصورة إلى 10 كسور من نفس المنطقة، من المشبك المناعي إلى الحد الأعلى للخلية. قياس الفلوريس في كل الكسر ض وحساب النسبة المئوية للفلوريسانس عن طريق قسمة الفلوريسين في كل ض-كسر على الفلورا الكلية للخلية.
وأخيراً، رسم النسبة المئوية لنسبة كثافة الفلوريسين لكل ض-كسر. يمثل الكسر الأول والاثنان الواجهة المتشابكة. هنا هو سير العمل أو إجراء العزل المركزية.
استخدام 20 مليون خلية B لكل حالة. قبل علاج الخلايا مع السيتوكلاسين D و Nocodazole وفقا للبروتوكول المطلوب لتسهيل انفصال المركزية. بعد ذلك ، مشاهدة الخلايا عن طريق إعادة تعليق لهم في 5 مل من العازلة TBS.
كرر باستخدام 1 مل من 0.1x TBS العازلة تكملها 8٪ السكروز. Resuspend بيليه الخلية مع 150 microliters من العازلة تحلل. جهاز طرد مركزي في 10،000 غرام لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية لفصل السيتوسول والعضيات من النواة.
استرداد بعناية الخلية فائقة ووضع على رأس أنبوب 1.5 مل. ملء مع 300 ميكروليتر من المخزن المؤقت التدرج تكملها 60٪ السكروز. عينات من أجهزة الطرد المركزي في 10،000 غرام لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
هذه الخطوة الطرد المركزي مهم لتركيز المركزية. بعد الطرد المركزي، قم بإزالة المابير بعناية حتى تصل إلى الواجهة. دوامة العينة المتبقية في الأنبوب.
إعداد التدرج السكروز متقطع في أنبوب الريف الفائقة عن طريق تراكب 0.45 مل من 70٪ سكروز، مع 0.27 مل من 50٪ السكروز، ومن ثم 0.27 مل من 40٪ السكروز في المخزن المؤقت الانحدار. ضع العينات ذات الإثراء المركزي على التدرج غير المتجاور ومعايرة وزن كل عينة في المحولات المعنية. الطرد المركزي الأنابيب في 40، 000 غرام لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية، مع الحد الأدنى من التسارع ودون كسر لتجنب الانزعاج التدرج.
بعد الطرد المركزي، وجمع بعناية 12 كسور مع حجم متساو. إعادة تعليق العينة مع تحميل المخزن المؤقت وتشغيل صفحة SDS. لدراسة توزيع العضية في الخلايا B أثناء تشكيل المشبك المناعي، استخدمنا خلايا 2A1.6 B تنشيطها مع الخرز المغلفة مستضد لنقاط زمنية مختلفة.
كتحكم، تم تنشيط الخلايا B مع الخرز التي تحتوي على BCR-ligand لا علاقة لها. ثم نقوم، باستخدام تلطيخ الفلورات المناعية، باكتشاف العضيات المختلفة، التي تغير مكانها عند التنشيط باستخدام مستضدات معطلة. نعرض هنا centrosome، وصفت مع ألفا توبولين وجهاز غولجي المسمى مع Rab6a.
في الرسم البياني، نعرض مؤشر القطبية لـ أقطابية المركزية وgolgi جهاز قطبية verus كل نقطة وقت التنشيط، والتي تمثل كل نقطة خلية واحدة. خلال التنشيط، يمكننا أن نلاحظ أن مؤشرات القطبية لهذه العضيات تصل إلى قيم أقرب إلى 1، مما يشير إلى زيادة في توظيفها إلى IS.Organelles التي تعرض توزيعًا أكثر تشتتًا، مثل الليسوسومات، يمكن أيضًا تحديد كمي باستخدام مؤشر قطبي. يمكننا أن نلاحظ أن مؤشر القطبية من lyososome سوف تصل إلى قيم أكثر إيجابية عند التنشيط، والتي تنتج عن التوظيف في IS. نظهر نهجًا تكميليًا لتحديد كمي لتوظيف الليسوسوم نحو المشبك المناعي.
باستخدام نفس بروتوكول التنشيط مع الخرز المغلفة بالمضاد ، تم حساب التوظيف في IS عن طريق تحديد علامة الفلورومس التي تم تجنيدها في المنطقة المحددة حول الخرز أو داخل المنطقة المتشابكة. يمكننا ملاحظة هذا التنشيط المفتوح. هناك زيادة في lysosomes مقرونة بموقع المشبك.
هنا نقدم القياس الكمي actin في مركز في الخلايا B تنشيطها مع الخرز مستضد محددة وغير محددة. تتم الإشارة إلى تجمع actin بسهم. يمكن أن يمثل القياس الكمي للمكونات المرتبطة بالقِدَر المركزية، مثل actin في هذه الحالة، بواسطة رسم نقطة، حيث تمثل كل نقطة خلية واحدة.
بعد التنشيط، الخلية B تقليل في مقدار actin حول centrosome. هذه الخطوة مهمة لفصل المركزية من المنطقة الم perinuclear للسماح الاستقطاب إلى المشبك الجديد. بالنسبة لخلية B التي يتم تنشيطها على السطح المغلف بالمستضد ، يمكنك دراسة إعادة عرض actin وكذلك توظيف العضيات إلى الغشاء المتشابك.
هنا نعرض تحليل العضيات، مثل جهاز غولجي و إندوبلاسميك ريتيكولوم، والتي تعرض توزيع مركزي وطرفي، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، يمكننا حساب منطقة الانتشار من الخلايا B بعد نقاط زمنية مختلفة من التنشيط. لهذا الغرض، نقوم بتسمية actin لتكون قادرة على تحديد حد الخلية في المستوى XY.
في الرسم البياني، يمكنك ملاحظة الزيادة في منطقة الخلية بعد 30 و 60 دقيقة من التنشيط. ويمكن أيضا أن يتم حساب توزيع organelle في الطائرة XZ في كل من واجهة متشابك. يمثل الرسم البياني توزيع actin في المستوى z، حيث يتوافق أول طائرتين مع الواجهة المتشابكة.
يمكننا أن نلاحظ أن actin يصبح إثراء في هذا المجال عند تفعيل. بالإضافة إلى تحليل التصوير، يمكن استخدام النهج الكيميائي الحيوي أيضًا لدراسة التغيير في التركيبة المركزية عند تنشيط الخلية B. نعرض هنا لطخة غربية تمثيلية من الكسر المحتوي على المركزية الذي أبرزه المستطيل البيج.
تم عزل الكسور المركزية على تدرج السكروز غير متقطع وتم اكتشافها عن طريق تسوية جاما توبولين. يظهر البقعة الغربية أدناه actin و Arp2 في كسور المركزية من الخلايا باء يستريح، والتي تصبح مستنفدة عند التنشيط. B اللمفاويات تخضع تغييرات ديناميكية في واجهة الغشاء من أجل تشكيل المشبك المناعي وظيفية.
يمكن دراسة هذه العملية بواسطة تقنيات التصوير والبيوكيميائية الموصوفة هنا في هذا الفيديو. ونحن نعتقد أن هذا التحليل يمكن أن توفر معلومات قيمة على الآليات الجزيئية المعنية حول كيفية الخلايا B يمكن أن تصبح فعالة تنشيط.
