Наш протокол позволяет измерять скорость аутофагии и протеасомной активности в тканях мыши и достаточно чувствителен для обнаружения циркадных вариаций в этих действиях. Этот метод может быть использован in vivo для оценки белка катаболизма в клетках и тканях и необходимые материалы являются относительно низкими технологиями и доступны для любой лаборатории молекулярной биологии. Демонстрацией процедуры будет Михаил Рыжиков, пост-док из моей лаборатории.
За пятнадцать минут до каждой точки времени, тепло лейпептин и бортезомиб фондовых решений для комнатной температуры и разбавить талый бортезомиб в стерильных PBS, чтобы дать 50 миллиграмм на миллилитр рабочий раствор. Для введения ингибитора протеазы интраперитонно вводят 40 миллиграммов на килограмм лейпептина или 1,6 микрограмма на килограмм бортезомиба в каждое экспериментальное животное. Для отрицательного контроля, вводить мышей с 0,5 миллилитров PBS.
Верните каждую мышь в клетки, сгруппированные по типу лечения, полученного при введении, и завещать время, в течение которого мышей лечат или манипулируют в стандартизированной таблице. Через два часа после инъекции, погрузить левую долей печени, собранной из каждого принесенного в жертву экспериментального животного в семи миллилитров ледяной гомогенизации буфера в надлежащим образом помечены 15 миллилитров конических трубок на льду. Когда все образцы были приобретены, перенесите первый образец и весь объем буфера гомогенизации в 15 миллилитровую емкость гомогенизатора Dounce и гомогенизируйте образец с 10 штрихами свободного поршня и 15 штрихами плотного поршня.
Верните в результате сырой гомогенат в свою оригинальную трубку и гомогенизируйте следующий образец, как только что продемонстрировано. Когда все образцы были гомогенизированы, осадок гомогенатных ядер и мусора центрифугации и передачи верхней четыре миллилитров каждого пост-ядерного супернатанта в новые 15 миллилитров труб. Определите концентрацию белка этой первой супернатантной фракции в соответствии со стандартными протоколами и уравняйте концентрации всех образцов до 2,1 миллиграмма на миллилитр со свежим буфером гомогенизации по мере необходимости.
Для анализа вниз по течению и улучшения качества, aliquot 500 микролитров нормализованного общего белка фракций в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки для хранения минус 80 градусов по Цельсию. Передача 1,5 миллилитров каждой из оставшихся общих белковых фракций в отдельные микроцентрифугные трубки и гранулы образцов белка центрифугации. Перенесите один миллилитр полученных супернатантов второй фракции в новые микроцентрифуговые трубки на льду и аспирировать оставшиеся супернатанты.
Вымойте 3K гранулы два раза в 1,5 миллилитров свежего холодного буфера гомогенизации на стирку, затем повторно 3K гранулы в 200 микролитров буфера образца SDS-PAGE и варить образцы при 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Спин второй фракции supernatants в течение 20 минут на 20000 х и четыре градуса по Цельсию и передачи в результате третьей цитоплазмы фракции supernatants в новую трубку микроцентрифуг. Для анализа SDS-PAGE объедините 150 микролитров цитоплазмической фракции с 50 микролитров буфера образца 4x SDS-PAGE и варите образцы цитоплазмических фракций при 95 градусах Цельсия в течение пяти минут.
Аспирировать оставшийся супернатант из гранул 20K и мыть образцы два раза с 1,5 миллилитров свежего холодного буфера гомогенизации на стирку. Затем повторно 20K гранулы в 100 микролитров SDS-PAGE образца буфера для кипения при 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Для западного анализа помарки, последовательно разбавляют стандартные протеины кривой от одного до 3 в буфере образца 1x для итога 6 разбавлений и нагрузки 10 микролитров каждого стандартного образца кривого в один хорошо 26 наилучшим образом 4 до 12%SDS-PAGE midi гель, после этого загрузите prestained коммерчески молекулярный стандарт веса.
Для измерения аутофаготического потока загрузите 12 микролитров каждого образца гранул 3K в соответствующие скважины. Для измерения протеасомного потока загрузите 12 микролитров каждой цитоплазмической фракции в соответствующие скважины. Когда все контрольные и экспериментальные образцы были загружены, отделить образцы белка SDS-PAGE перед передачей белков в поливинилин фторсодержажных мембран в соответствии со стандартными протоколами.
Для анализа макроавтофагического потока, пятно мембран, содержащих 3K гранул образцов с анти-p62 или анти-LcB антитела ночь на четыре градуса по Цельсию. Для анализа протеасомного потока, пятно мембран, содержащих цитоплазмические образцы фракции с антилизином 48-Специфические поли убиквитин антитела ночь на четыре градуса цельсия. Затем изображение западных пятен с помощью стандартных вторичных антител и изображений устройств.
Для выполнения денситометрических измерений на полосах, представляющих интерес как для стандартной кривой, так и для экспериментальных образцов, откройте соответствующую программу анализа изображений и нарисуйте длинный прямоугольник, охватывающий представляющий интерес белок в нижней части помарки изображения, простирающегося в верхней части мембраны. Копировать и вставлять, чтобы переместить прямоугольник в оставшиеся образцы, сохраняя прямоугольник в соответствии между образцами. Сохраните квантификацию в электронной таблице и создайте денситометрическую стандартную кривую в электронной таблице, используя последовательно разбавленный стандартный образец в линейной или полиномиальной регрессии для получения наилучшего стандартного уравнения кривой.
Используя это уравнение, экстраполировать количество мономеров, представляющих интерес в экспериментальных образцах. Для получения измерений потока вычесть экстраполированное количество белка каждого ингибитора обработанный образец из среднего значения образцов PBS из той же точки времени. Затем оцените статистическую значимость временного изменения оборота белка с помощью одной стороны ANOVA.
Первичным считыванием для аутофагического потока в любой момент времени является разница в количестве макроавтофагии конкретных маркеров между леупептином обработаны по сравнению с фиктивными образцами в лизосом-обогащенной 3K гранулы фракции разделены на два. Как правило, результаты нормализуются до среднего, что упрощает сравнение независимых экспериментов. Наша процедура измерения протеолитического потока зависит от способности лейпептина или бортезомиба вызывать накопление аутофагии и протеасомных субстратов, что зависит от времени процесса.
Этот метод позволил исследование того, как биологические ритмы программы печени белка катаболизма. Мы надеемся, что это проложит путь для изучения влияния болезни на функции клеточного домашнего хозяйства.
