שיטה זו מאפשרת לחקור תאי T ו- B ספציפיים ברמת הנוקלאוטידים או חומצות האמינו ובכך לזהות שינויים דינמיים באוכלוסיות לימפוציטים ופרמטרי גיוון בהפרעות שונות. היתרון של רצף הדור הבא הוא היכולת לזהות שיבוטים ייחודיים של תאי T או B ולעקוב אחריהם באתרים אנטומיים שונים או באנשים שונים. יש לזה פוטנציאל לזיהוי סמנים ביולוגיים חדשניים במחלות מגוונות.
מי שתדגים את ההליך הזה תהיה נעמי סלמון, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי. התחל על ידי ביצוע עיכול ותזת תאים של ביופסיות מעיים. יש לאחזר ביופסיות מעיים שנאספו זה עתה או אוחסנו ב-20 מעלות צלזיוס שליליות או שליליות.
אם משתמשים בביופסיות קפואות, מפשירים אותן על קרח. הוסף 600 מיקרוליטרים של תמיסת תמיסת גרעינים לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 1.7 מיליליטר, מקורר על קרח. ואז למקם ביופסיה לתוך הצינור, ולהדגיר אותו ב 65 מעלות צלזיוס במשך 15 עד 30 דקות.
הוסיפו 17.5 מיקרוליטרים של 20 מיליגרם למיליליטר חלבון K, ודגרו את הצינור למשך הלילה ב-55 מעלות צלזיוס, עם רעידות עדינות. לאחר הדגירה, לאפשר לדגימה להתקרר לטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לבידוד DNA מדם, בעדינות לטלטל את הצינור עד שהוא מעורבב ביסודיות.
ואז להעביר דם לצינור צנטריפוגה סטרילי 15 מיליליטר המכיל תשעה מיליליטר של תמיסת תמוגה התא. הפוך את הצינור מספר פעמים במהלך תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה ב 600 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
ואז להשליך כמה שיותר על טבעי ככל האפשר מבלי להפריע גלולה לבנה גלוי. וורטקס הצינור במרץ במשך 15 שניות עד לשימוש חוזר לחלוטין. הוסף שלושה מיליליטרים של פתרון תמוגה גרעינית, פיפטה מספר פעמים, גורם הפתרון להיות צמיג.
מוסיפים למדגם מאגר משקעים לחלבון. ואז מערבולת נמרצת במשך 20 שניות, ולהדגיר אותו על קרח במשך חמש דקות. צנטריפוגה ב 16, 000g במשך ארבע דקות כדי ליצור גלולה הדוקה המכילה את החלבונים מזרז.
בזהירות להעביר supernatant מבלי להפריע גלולה לצינור חדש 1.7 מיליליטר. מוסיפים מיליליטר אחד של 2-propanol לצינור המכיל את supernatant, בעדינות לערבב אותו על ידי היפוך. הדנ"א צריך להיות גלוי כחומר צף לבן.
צנטריפוגה ב 16, 000 פעמים g לדקה אחת, ולהסיר את supernatant לחלוטין. מוסיפים מיליליטר אחד של 70% אתנול שהוכן זה עתה, וממירים את הצינור מספר פעמים. צנטריפוגה זה ב 16, 000 גרם לדקה אחת בטמפרטורת החדר.
ואז בזהירות להשליך את supernatant. חזור על שטיפת האתנול. ואז להשאיר את גלולת ה-DNA לייבוש אוויר במשך 10 עד 15 דקות.
הוסיפו לדנ"א 50 מיקרוליטרים של מים טהורים במיוחד, ובצעו כימות דנ"א כמתואר בכתב היד. השתמש 150 ננוגרם של DNA כדי להכין את הספרייה לריצוף. מניחים פיפטות וטיפים למכסה המנוע עם אור UV במשך 15 דקות כדי לשבור את ה-DNA שיורית.
בינתיים, אפשרו לצינורות האינדקס השונים ולפולימראז הדנ"א להפשיר על הקרח. במכסה המנוע הביולוגי, להוסיף 45 microliters מצינורות אינדקס שונים לצינורות PCR, דואג למנוע זיהום צולב. לאחר מכן להוסיף 0.2 microliters של פולימראז DNA וחמישה microliters של ה-DNA מוכן לתוך צינורות PCR.
הפעל PCR באמצעות תוכנית מוגדרת מראש בהתאם להוראות היצרן. השתמש חרוזים מגנטיים להסרת פרייומרים עודפים, נוקלאוטידים, ואנזימים. מחממים את החרוזים לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות, ומכינים מספיק 80% אתנול טרי ל-400 מיקרוליטר לדגימה.
מוסיפים את החרוזים לכל צינור PCR, ומערבבים על ידי pipetting 10 פעמים. דגירה הצינורות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. מניחים את המדגם המעורב על המעמד המגנטי במשך חמש דקות.
ואז לשאוף את הנוזל שקוף, ולהשליך. לשאוף את הנוזל הנותר באמצעות קצה 10 מיקרוליטר. מוסיפים 200 מיקרוליטרים של 80% אתנול לכל דגימה, ומדגרים במשך 30 שניות.
לשאוף 195 מיקרוליטרים של אתנול, ולהשליך. ואז לשאוף את הנוזל הנותר באמצעות קצה 10 מיקרוליטר. חזור על שטיפת האתנול.
ואז לפתוח את הכובעים של הצינורות, ולתת להם אוויר יבש במשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, להסיר את הדגימות מן המעמד המגנטי, ולהוסיף 25 microliters של מאגר elution. מערבבים על ידי pipetting עד הומוגני, ו הדגירה בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות.
מניחים את הצינורות על המעמד המגנטי במשך חמש דקות. לאחר מכן להעביר 22 microliters לצינור PCR חדש, ולמדוד את ריכוז ה-DNA. לכמת את האמפליקון כמתואר בכתב היד של הטקסט.
לאחר חישוב ריכוז הדנ"א הסופי והגודל בזוגות הבסיס של שיא המוצר, הכינו תערובת דילול חדשה לכל דגימה, והעבירו שני מיקרוליטרים שלה לתמהיל בריכה חדש. הכינו פתרון טרי של נתרן הידרוקסידי 0.2 רגיל, והוסיפו 10 מיקרוליטרים לספריה המדוללת. דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לרוקן את הדנ"א הדו-גדילי.
לאחר מכן הוסיפו 980 מיקרוליטרים של חיץ מצונן מראש מהערכה לצינור המכיל דנ"א, ומערבולת בקצרה. טען 600 מיקרוליטרים של הספריה הסופית על המחסנית הייעודית והנח את הדגימות במכונה. כדי לבצע ניתוח רצף, הורד מדדי רצף מהרצף וודא שהנתונים נמצאים בטווחים המתאימים.
חזור על ההפעלה עבור דוגמאות שאינן עומדות בקריטריונים. פרוטוקול זה שימש לביצוע ניתוח בסיסי של דגימות דם אוטולוגיות ופי הטבעת מייצגות של חולה עם מחסור בקולטן IL10 והיסטוריה של מחלת קשב ודם אינפנטילית חמורה. דגימות הושלכו הן לרפרטואר TCR-בטא והן לרפרטואר IGH.
כל השיבוטים ניתן לזהות על ידי הרצף הייחודי שלהם ברמת נוקלאוטידים או חומצת אמינו. רצפים אלה ניתן להשוות בין חולים שונים בחיפוש אחר שיבוטים משותפים או באותו חולה בין אתרים אנטומיים שונים. חמשת השיבוטים השכיחים ביותר עבור כל דגימה מוצגים כאן.
תמונות TreeMap נוצרו עבור סקירה רחבה של הרפרטואר. כל ריבוע צבעוני מייצג שיבוט שונה, והגודל תואם לתדר שלו. תמונות TreeMap אלה מדגימות התרחבות שיבוט ברפרטואר IGH במעיים.
לעומת זאת, ברפרטואר TCR-בטא, התפשטות שיבוט מסומן נצפתה בדם בהשוואה למעי האוטולוגי. ברמת הגנים, NGS מספק מידע לגבי שימוש V, D ו- J ברמה של גן, משפחה או אלל. יתר על כן, שילובים ספציפיים VDJ ניתן להסיק מן הנתונים עבור TCR-בטא ורפרטוארים IGH, חושף דפוסי שימוש בגנים דיפרנציאליים בתנאים שונים.
פרוטוקול זה יכול להיות מיושם הן על DNA והן על RNA וניתן להשתמש בו כדי ליצור TCR-אלפא, TCR-גמא, ורפרטואר IGL. זה גם תואם עם איברים אחרים לאחר שינויים קלים בעיכול.
