Этот метод позволяет исследовать специфические Т- и В-клетки на нуклеотидном или аминокислотном уровне и, таким образом, может идентифицировать динамические изменения в популяциях лимфоцитов и параметры разнообразия при различных расстройствах. Преимуществом секвенирования следующего поколения является возможность идентифицировать уникальные клоны Т- или В-клеток и отслеживать их в разных анатомических местах или у разных людей. Это имеет потенциал для идентификации новых биомаркеров при различных заболеваниях.
Продемонстрировать эту процедуру будет Наоми Саламон, научный сотрудник из моей лаборатории. Начните с выполнения пищеварения и лизиса клеток биопсии кишечника. Извлеките биопсию кишечника либо свежесбранной, либо хранящейся при отрицательных 20 или отрицательных 80 градусах Цельсия.
Если вы используете замороженные биопсии, разморозьте их на льду. Добавьте 600 микролитров раствора лизиса ядер в стерильную 1,7-миллилитровую микроцентрифужную трубку, охлажденный на льду. Затем поместите биопсию в трубку и инкубируют ее при 65 градусах Цельсия в течение 15-30 минут.
Добавьте 17,5 микролитров 20-миллиграммов на миллилитр протеиназы К и инкубируют трубку в течение ночи при 55 градусах Цельсия с легким встряхиванием. После инкубации дайте образцу остыть до комнатной температуры в течение пяти минут. Для выделения ДНК из крови осторожно раскачивайте трубку, пока она не будет тщательно перемешана.
Затем переложите кровь в стерильную 15-миллилитровую центрифужную трубку, содержащую девять миллилитров раствора лизиса клеток. Инвертировать трубку несколько раз в течение 10-минутного инкубационного периода при комнатной температуре. Центрифуга при 600г в течение 10 минут при комнатной температуре.
Затем выбросьте как можно больше супернатанта, не нарушая видимую белую гранулу. Вихряйте трубку энергично в течение 15 секунд до полного повторного суспендирований. Добавьте три миллилитра раствора лизиса ядер и пипетку несколько раз, в результате чего раствор станет вязким.
Добавьте буфер осаждения белка в образец. Затем энергично вихрь в течение 20 секунд, и высиживая его на льду в течение пяти минут. Центрифугу по 16 000 г в течение четырех минут с образованием плотной гранулы, содержащей осажденные белки.
Осторожно перенесите супернатант, не нарушая гранулу, в новую 1,7-миллилитровую трубку. Добавьте один миллилитр 2-пропанола в пробирку, содержащую супернатант, и осторожно перемешайте его путем инвертирования. ДНК должна стать видимой как белое плавающее вещество.
Центрифугу по 16 000 раз г в течение одной минуты и удалите супернатант полностью. Добавьте один миллилитр свежеприготовленного 70%-го этанола и несколько раз переверняйте пробирку. Центрифугировать его при 16 000 г в течение одной минуты при комнатной температуре.
Затем осторожно выбросьте супернатант. Повторите промывку этанолом. Затем оставьте гранулу ДНК сушиться на воздухе в течение 10-15 минут.
Добавьте 50 микролитров сверхчистой воды в ДНК и выполните количественную оценку ДНК, как описано в текстовой рукописи. Используйте 150 нанограммов ДНК, чтобы подготовить библиотеку к секвенированию. Поместите пипетки и наконечники в капюшон с ультрафиолетовым светом на 15 минут, чтобы разрушить остаточную ДНК.
Между тем, позвольте различным индексным пробиркам и ДНК-полимеразе оттаивать на льду. В биологической вытяжке добавьте 45 микролитров из различных индексных пробирок в трубки ПЦР, заботясь о том, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Затем добавляют 0,2 микролитра ДНК-полимеразы и пять микролитров подготовленной ДНК в трубки ПЦР.
Запустите ПЦР с помощью предустановленной программы в соответствии с инструкциями производителя. Используйте магнитные шарики для удаления излишков праймеров, нуклеотидов и ферментов. Прогрейте бусины до комнатной температуры не менее 30 минут и приготовьте достаточно свежего 80%-ного этанола на 400 микролитров на образец.
Добавьте шарики в каждую трубку ПЦР и перемешайте, пипетировка 10 раз. Инкубировать тубы в течение 10 минут при комнатной температуре. Поместите смешанный образец на магнитную подставку на пять минут.
Затем аспирировать прозрачную жидкость и выбросить. Аспирировать оставшуюся жидкость с помощью 10-микролитрового наконечника. Добавьте 200 микролитров 80% этанола в каждый образец и инкубировать в течение 30 секунд.
Аспирировать 195 микролитров этанола и выбросить. Затем аспирировать оставшуюся жидкость с помощью 10-микролитрового наконечника. Повторите промывку этанолом.
Затем откройте колпачки трубок и дайте им высохнуть на воздухе в течение пяти минут. Через пять минут извлеките образцы из магнитного стенда и добавьте 25 микролитров буфера элюирования. Перемешать путем пипетки до однородности и инкубировать при комнатной температуре в течение двух минут.
Поместите трубки на магнитную подставку на пять минут. Затем переложите 22 микролитра в новую ПЦР-трубку и измерьте концентрацию ДНК. Количественно оценить ампликон, как описано в тексте рукописи.
После расчета конечной концентрации ДНК и размера в парах оснований пика продукта, подготовьте новую смесь разбавления для каждого образца и перенесите два микролитра ее в новую смесь для бассейна. Приготовьте свежий раствор 0,2 нормального гидроксида натрия и добавьте в разбавленный библиотеку 10 микролитров. Инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы детазать двухцепочечную ДНК.
Затем добавьте 980 микролитров предварительно охлажденного буфера из набора в трубку, содержащую ДНК, и кратковременно вихрь. Загрузите 600 микролитров конечной библиотеки на назначенный картридж и поместите образцы в машину. Чтобы выполнить анализ последовательности, загрузите метрики виртуализации из секвенсора и убедитесь, что данные находятся в соответствующих диапазонах.
Повторите запуск для образцов, которые не соответствуют критериям. Этот протокол был использован для выполнения базового анализа репрезентативных аутологических образцов крови и ректальной части пациента с дефицитом рецептора IL10 и историей тяжелого инфантильного начала ВЗК. Сэмплы были проанализированы как для репертуара TCR-beta, так и для репертуара IGH.
Все клоны могут быть идентифицированы по их уникальной последовательности на нуклеотидном или аминокислотном уровне. Эти последовательности можно сравнивать между разными пациентами в поисках общих клонов или у одного и того же пациента между разными анатомическими участками. Пять наиболее часто встречаемых клонов для каждого примера показаны здесь.
Изображения TreeMap были сгенерированы для широкого обзора репертуара. Каждый цветной квадрат представляет собой свой клон, а размер коррелирует с его частотой. Эти изображения TreeMap демонстрируют клональное расширение в репертуаре IGH кишечника.
Напротив, в репертуаре TCR-beta в крови наблюдается выраженное клональное расширение по сравнению с аутологичной кишками. На генном уровне NGS предоставляет информацию об использовании V, D и J на уровне гена, семейства или аллеля. Кроме того, конкретные комбинации VDJ могут быть выведены из данных для репертуаров TCR-beta и IGH, выявляя дифференциальные модели использования генов в различных условиях.
Этот протокол может быть применен как к ДНК, так и к РНК и может быть использован для генерации репертуаров TCR-альфа, TCR-гамма и IGL. Он также совместим с другими органами после незначительных изменений пищеварения.
