Este método permite a exploração de células T e B específicas no nível nucleotídeo ou aminoácido e, assim, pode identificar mudanças dinâmicas nas populações de linfócitos e parâmetros de diversidade em diferentes transtornos. A vantagem do sequenciamento de próxima geração é a capacidade de identificar clones de células T ou B únicos e rastreá-los em diferentes locais anatômicos ou em diferentes indivíduos. Isso tem potencial para identificação de novos biomarcadores em diversas doenças.
Demonstrando que o procedimento será Naomi Salamon, uma assistente de pesquisa do meu laboratório. Comece realizando digestão e lise celular de biópsias intestinais. Recuperar biópsias intestinais recém-coletadas ou armazenadas a 20 negativos ou negativos 80 graus Celsius.
Se usar biópsias congeladas, descongele-as no gelo. Adicione 600 microliters de solução de lise nuclei a um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro estéril, refrigerado no gelo. Em seguida, coloque uma biópsia no tubo, e incuba-a a 65 graus Celsius por 15 a 30 minutos.
Adicione 17,5 microliters de 20 miligramas por mililitro proteinase K, e incubar o tubo durante a noite a 55 graus Celsius, com agitação suave. Após a incubação, deixe a amostra esfriar até a temperatura ambiente por cinco minutos. Para o isolamento do DNA do sangue, balance suavemente o tubo até que esteja completamente misturado.
Em seguida, transfira sangue para um tubo de centrífuga de 15 mililitros estéril contendo nove mililitros de solução de lise celular. Inverta o tubo várias vezes durante um período de incubação de 10 minutos à temperatura ambiente. Centrífuga a 600g por 10 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, descarte o máximo de supernasce possível sem perturbar a pelota branca visível. Vórtice o tubo vigorosamente por 15 segundos até que completamente resuspended. Adicione três mililitros de solução de lise nuclei e pipeta várias vezes, fazendo com que a solução se torne viscosa.
Adicione tampão de precipitação proteica à amostra. Em seguida, vórtice vigorosamente por 20 segundos, e incuba-lo no gelo por cinco minutos. Centrífuga a 16.000g por quatro minutos para formar uma pelota apertada contendo as proteínas precipitadas.
Transfira cuidadosamente o supernante sem perturbar a pelota para um novo tubo de 1,7 mililitro. Adicione um mililitro de 2-propanol ao tubo contendo o supernasal, e misture-o suavemente invertendo. O DNA deve se tornar visível como uma substância flutuante branca.
Centrifugar a 16.000 vezes g por um minuto, e remover o supernatante completamente. Adicione um mililitro de 70% de etanol recém-preparado, e inverta o tubo várias vezes. Centrifuá-lo a 16.000g por um minuto à temperatura ambiente.
Em seguida, descarte cuidadosamente o supernaspe. Repita a lavagem do etanol. Em seguida, deixe a pelota de DNA para secar o ar por 10 a 15 minutos.
Adicione 50 microliters de água ultra-pura ao DNA, e realize a quantificação de DNA conforme descrito no manuscrito do texto. Use 150 nanogramas de DNA para preparar a biblioteca para sequenciamento. Coloque pipetas e pontas no capô com luz UV por 15 minutos para quebrar o DNA residual.
Enquanto isso, permita que os diferentes tubos de índice e polimerase de DNA descongelem no gelo. Em uma capa biológica, adicione 45 microliters dos diferentes tubos de índice aos tubos PCR, tomando cuidado para evitar a contaminação cruzada. Em seguida, adicione 0,2 microliters da polimerase de DNA e cinco microliters do DNA preparado nos tubos PCR.
Execute o PCR usando um programa predefinido de acordo com as instruções do fabricante. Use contas magnéticas para remoção de primers em excesso, nucleotídeos e enzimas. Aqueça as contas à temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos, e prepare 80% de etanol fresco suficiente para 400 microliters por amostra.
Adicione as contas a cada tubo PCR e misture por pipetar 10 vezes. Incubar os tubos por 10 minutos em temperatura ambiente. Coloque a amostra mista no suporte magnético por cinco minutos.
Em seguida, aspire o líquido claro e descarte. Aspire o líquido restante usando uma ponta de 10 microliter. Adicione 200 microliters de 80% de etanol a cada amostra e incubar por 30 segundos.
Aspirar 195 microliters de etanol, e descartar. Em seguida, aspire o líquido restante usando uma ponta de 10 microliter. Repita a lavagem do etanol.
Em seguida, abra as tampas dos tubos, e deixe-os secar o ar por cinco minutos. Após cinco minutos, remova as amostras do suporte magnético e adicione 25 microliters de tampão de elução. Misture por pipetar até ficar homogêneo e incubar à temperatura ambiente por dois minutos.
Coloque os tubos no suporte magnético por cinco minutos. Em seguida, transfira 22 microliters para um novo tubo PCR, e meça a concentração de DNA. Quantifique o amplicon como descrito no manuscrito do texto.
Depois de calcular a concentração final de DNA e o tamanho em pares de base do pico do produto, prepare uma nova mistura de diluição para cada amostra e transfira dois microliters para uma nova mistura de piscina. Prepare uma solução fresca de hidróxido de sódio normal de 0,2 e adicione 10 microliters à biblioteca diluída. Incubar por cinco minutos à temperatura ambiente para desnaturar o DNA de dois fios.
Em seguida, adicione 980 microliters de tampão pré-refrigerado do kit ao tubo contendo DNA, e vórtice brevemente. Carregue 600 microliters da biblioteca final no cartucho designado e coloque as amostras na máquina. Para realizar a análise de sequenciamento, baixe métricas de sequenciamento do sequenciador e verifique se os dados estão dentro das faixas apropriadas.
Repita a execução para amostras que não atendam aos critérios. Este protocolo foi utilizado para realizar uma análise básica de amostras representativas de sangue autólogo e retal de um paciente com deficiência de receptor IL10 e histórico de IBD de início infantil grave. As amostras foram avaliadas tanto para o repertório TCR-beta quanto para o IGH.
Todos os clones podem ser identificados por sua sequência única no nível nucleotídeo ou aminoácido. Essas sequências podem ser comparadas entre diferentes pacientes em busca de clones compartilhados ou no mesmo paciente entre diferentes locais anatômicos. Os cinco clones mais frequentes para cada amostra são mostrados aqui.
As imagens do TreeMap foram geradas para uma visão geral ampla do repertório. Cada quadrado colorido representa um clone diferente, e o tamanho se correlaciona com sua frequência. Estas imagens do TreeMap demonstram expansão clonal no repertório IGH intestinal.
Em contraste, no repertório TCR-beta, a expansão clonal marcada é observada no sangue em comparação com o intestino autólogo. No nível genético, o NGS fornece informações sobre o uso de V, D e J no nível de gene, família ou alelo. Além disso, combinações específicas de VDJ podem ser inferidas a partir dos dados para repertórios TCR-beta e IGH, revelando padrões diferenciais de uso de genes em várias condições.
Este protocolo pode ser aplicado tanto no DNA quanto no RNA e pode ser usado para gerar repertórios TCR-alfa, TCR-gama e IGL. Também é compatível com outros órgãos após pequenas modificações de digestão.
