Cette méthode permet l’exploration de cellules T et B spécifiques au niveau des nucléotides ou des acides aminés et peut ainsi identifier des changements dynamiques dans les populations de lymphocytes et les paramètres de diversité dans différents troubles. L’avantage du séquençage de nouvelle génération est la capacité d’identifier des clones de cellules T ou B uniques et de les suivre dans différents sites anatomiques ou chez différents individus. Cela a le potentiel d’identifier de nouveaux biomarqueurs dans diverses maladies.
Naomi Salamon, une assistante de recherche de mon laboratoire, démontrera cette procédure. Commencez par effectuer la digestion et la lyse cellulaire des biopsies intestinales. Récupérer des biopsies intestinales fraîchement collectées ou stockées à moins 20 ou moins 80 degrés Celsius.
Si vous utilisez des biopsies congelées, décongelez-les sur de la glace. Ajouter 600 microlitres de solution de nucléilyse à un tube de microcentrifuge stérile de 1,7 millilitre, réfrigéré sur de la glace. Ensuite, placez une biopsie dans le tube et incuber à 65 degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes.
Ajouter 17,5 microlitres de 20 milligrammes de protéinase K de 20 millilitres et incuber le tube pendant la nuit à 55 degrés Celsius, en secouant doucement. Après l’incubation, laissez l’échantillon refroidir à température ambiante pendant cinq minutes. Pour l’isolement de l’ADN du sang, basculez doucement le tube jusqu’à ce qu’il soit soigneusement mélangé.
Ensuite, transférez le sang dans un tube de centrifugation stérile de 15 millilitres contenant neuf millilitres de solution de lyse cellulaire. Inverser le tube plusieurs fois au cours d’une période d’incubation de 10 minutes à température ambiante. Centrifuger à 600g pendant 10 minutes à température ambiante.
Ensuite, jetez autant de surnageant que possible sans perturber la pastille blanche visible. Vortex le tube vigoureusement pendant 15 secondes jusqu’à ce qu’il soit complètement ressuscité. Ajouter trois millilitres de solution de lyse des noyaux et pipeter plusieurs fois, ce qui rend la solution visqueuse.
Ajouter un tampon de précipitation de protéines à l’échantillon. Puis vortex vigoureusement pendant 20 secondes, et incuber sur la glace pendant cinq minutes. Centrifuger à 16 000 g pendant quatre minutes pour former une pastille serrée contenant les protéines précipitées.
Transférer soigneusement le surnageant sans perturber la pastille dans un nouveau tube de 1,7 millilitre. Ajouter un millilitre de 2-propanol au tube contenant le surnageant et le mélanger doucement en l’inversant. L’ADN doit devenir visible sous la forme d’une substance flottante blanche.
Centrifuger à 16 000 fois g pendant une minute et retirer complètement le surnageant. Ajouter un millilitre d’éthanol à 70% fraîchement préparé et inverser le tube plusieurs fois. Centrifuger à 16 000 g pendant une minute à température ambiante.
Ensuite, jetez soigneusement le surnageant. Répétez le lavage à l’éthanol. Laissez ensuite la pastille d’ADN sécher à l’air pendant 10 à 15 minutes.
Ajouter 50 microlitres d’eau ultra-pure à l’ADN et effectuer la quantification de l’ADN comme décrit dans le manuscrit textuel. Utilisez 150 nanogrammes d’ADN pour préparer la bibliothèque au séquençage. Placez les pipettes et les pointes dans le capot avec la lumière UV pendant 15 minutes pour décomposer l’ADN résiduel.
Pendant ce temps, laissez les différents tubes index et l’ADN polymérase dégeler sur la glace. Dans une hotte biologique, ajoutez 45 microlitres des différents tubes index aux tubes PCR, en prenant soin d’éviter la contamination croisée. Ajoutez ensuite 0,2 microlitres de l’ADN polymérase et cinq microlitres de l’ADN préparé dans les tubes pcr.
Exécutez la PCR à l’aide d’un programme prédéfini conformément aux instructions du fabricant. Utilisez des billes magnétiques pour éliminer les amorces, les nucléotides et les enzymes en excès. Réchauffer les billes à température ambiante pendant au moins 30 minutes et préparer suffisamment d’éthanol frais à 80% pour 400 microlitres par échantillon.
Ajouter les perles à chaque tube PCR, et mélanger par pipetage 10 fois. Incuber les tubes pendant 10 minutes à température ambiante. Placez l’échantillon mélangé sur le support magnétique pendant cinq minutes.
Ensuite, aspirez le liquide clair et jetez-le. Aspirer le liquide restant à l’aide d’une pointe de 10 microlitres. Ajouter 200 microlitres d’éthanol à 80 % à chaque échantillon et incuber pendant 30 secondes.
Aspirer 195 microlitres d’éthanol et jeter. Aspirez ensuite le liquide restant à l’aide d’une pointe de 10 microlitres. Répétez le lavage à l’éthanol.
Ouvrez ensuite les bouchons des tubes et laissez-les sécher à l’air pendant cinq minutes. Après cinq minutes, retirez les échantillons du support magnétique et ajoutez 25 microlitres de tampon d’élution. Mélanger par pipetage jusqu’à ce qu’il soit homogène, et incuber à température ambiante pendant deux minutes.
Placez les tubes sur le support magnétique pendant cinq minutes. Ensuite, transférez 22 microlitres dans un nouveau tube PCR et mesurez la concentration d’ADN. Quantifier l’amplicon tel que décrit dans le manuscrit de texte.
Après avoir calculé la concentration finale d’ADN et la taille en paires de bases du pic du produit, préparez un nouveau mélange de dilution pour chaque échantillon et transférez deux microlitres de celui-ci dans un nouveau mélange en piscine. Préparez une solution fraîche d’hydroxyde de sodium normal 0,2 et ajoutez 10 microlitres à la bibliothèque diluée. Incuber pendant cinq minutes à température ambiante pour dénaturer l’ADN double brin.
Ajoutez ensuite 980 microlitres de tampon pré-refroidi du kit au tube contenant de l’ADN, et vortex brièvement. Chargez 600 microlitres de la bibliothèque finale sur la cartouche désignée et placez les échantillons dans la machine. Pour effectuer une analyse de séquençage, téléchargez les métriques de séquençage à partir du séquenceur et vérifiez que les données se trouvent dans les plages appropriées.
Répétez l’exécution pour les échantillons qui ne répondent pas aux critères. Ce protocole a été employé pour exécuter une analyse de base du sang autologous représentatif et des échantillons rectaux d’un patient présentant l’insuffisance de récepteur IL10 et une histoire d’infantile-début grave IBD. Des échantillons ont été analysés pour le répertoire TCR-bêta et IGH.
Tous les clones peuvent être identifiés par leur séquence unique au niveau des nucléotides ou des acides aminés. Ces séquences peuvent être comparées entre différents patients à la recherche de clones partagés ou chez le même patient entre différents sites anatomiques. Les cinq clones les plus fréquents pour chaque échantillon sont présentés ici.
Des images TreeMap ont été générées pour une vue d’ensemble du répertoire. Chaque carré coloré représente un clone différent, et la taille est en corrélation avec sa fréquence. Ces images TreeMap démontrent l’expansion clonale dans le répertoire intestinal d’IGH.
En revanche, dans le répertoire TCR-bêta, une expansion clonale marquée est observée dans le sang par rapport à l’intestin autologue. Au niveau du gène, NGS fournit des informations concernant l’utilisation de V, D, et J au niveau du gène, de la famille, ou de l’allèle. D’ailleurs, des combinaisons spécifiques de VDJ peuvent être déduites des données pour des répertoires de TCR-bêta et d’IGH, révélant des modèles différentiels d’utilisation de gène dans diverses conditions.
Ce protocole peut être appliqué sur l’ADN et l’ARN et peut être utilisé pour générer des répertoires TCR-alpha, TCR-gamma et IGL. Il est également compatible avec d’autres organes après de légères modifications de digestion.
