Questo metodo consente l'esplorazione di specifiche cellule T e B a livello nucleotidico o amminoacido e può quindi identificare cambiamenti dinamici nelle popolazioni di linfociti e parametri di diversità in diversi disturbi. Il vantaggio del sequenziamento di nuova generazione è la capacità di identificare cloni di cellule T o B unici e rintracciarli in diversi siti anatomici o in individui diversi. Ciò ha il potenziale per identificare nuovi biomarcatori in diverse malattie.
A dimostrare questa procedura sarà Naomi Salamon, un'assistente di ricerca del mio laboratorio. Inizia eseguendo la digestione e la llisi cellulare delle biopsie intestinali. Recupera le biopsie intestinali appena raccolte o conservate a -20 o a -80 gradi Celsius.
Se si utilizzano biopsie congelate, scongelarle sul ghiaccio. Aggiungere 600 microlitri di soluzione di lysis nucleica a un tubo sterile a microcentrifugo da 1,7 millilitri, refrigerato sul ghiaccio. Quindi posizionare una biopsia nel tubo e incubarla a 65 gradi Celsius per 15-30 minuti.
Aggiungere 17,5 microlitri di proteinasi K da 20 milligrammi per millilitro e incubare il tubo durante la notte a 55 gradi Celsius, con un delicato scuotimento. Dopo l'incubazione, lasciare raffreddare il campione a temperatura ambiente per cinque minuti. Per l'isolamento del DNA dal sangue, scuotere delicatamente il tubo fino a quando non viene accuratamente miscelato.
Quindi trasferire il sangue in un tubo di centrifuga sterile da 15 millilitri contenente nove millilitri di soluzione di lisi cellulare. Invertire il tubo più volte durante un periodo di incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente. Centrifuga a 600g per 10 minuti a temperatura ambiente.
Quindi scartare il più supernatante possibile senza disturbare il pellet bianco visibile. Vortice vigorosamente il tubo per 15 secondi fino a quando non viene completamente rimescolato. Aggiungere tre millilitri di soluzione dilisi nucleica e pipetta più volte, causando la viscosità della soluzione.
Aggiungere il tampone di precipitazione proteica al campione. Quindi vortice vigorosamente per 20 secondi e incubarlo sul ghiaccio per cinque minuti. Centrifuga a 16.000g per quattro minuti per formare un pellet stretto contenente le proteine precipitate.
Trasferire con cura il supernatante senza disturbare il pellet in un nuovo tubo da 1,7 millilitri. Aggiungere un millilitro di 2-propanolo al tubo contenente il supernatante e mescolarlo delicatamente invertendo. Il DNA dovrebbe diventare visibile come una sostanza bianca fluttuante.
Centrifugare a 16.000 volte g per un minuto e rimuovere completamente il supernatante. Aggiungere un millilitro di etanolo appena preparato al 70% e invertire il tubo più volte. Centrifugarlo a 16.000 g per un minuto a temperatura ambiente.
Quindi scartare con cura il supernatante. Ripetere il lavaggio dell'etanolo. Quindi lasciare asciugare il pellet di DNA per 10-15 minuti.
Aggiungere 50 microlitri di acqua ultra pura al DNA ed eseguire la quantificazione del DNA come descritto nel manoscritto testuale. Usa 150 nanogrammi di DNA per preparare la libreria al sequenziamento. Posizionare pipette e punte nella cappa con luce UV per 15 minuti per abbattere il DNA residuo.
Nel frattempo, consentire ai diversi tubi indice e dna polimerasi di scongelarsi sul ghiaccio. In una cappa biologica, aggiungere 45 microlitri dai diversi tubi indice ai tubi PCR, facendo attenzione ad evitare la contaminazione incrociata. Quindi aggiungere 0,2 microlitri della DNA polimerasi e cinque microlitri del DNA preparato nei tubi PCR.
Eseguire PCR utilizzando un programma preimpostato secondo le istruzioni del produttore. Usa perline magnetiche per la rimozione di primer, nucleotidi ed enzimi in eccesso. Riscaldare le perline a temperatura ambiente per almeno 30 minuti e preparare abbastanza etanolo fresco all'80% per 400 microlitri per campione.
Aggiungere le perline a ciascun tubo PCR e mescolare pipettando 10 volte. Incubare i tubi per 10 minuti a temperatura ambiente. Posizionare il campione misto sul supporto magnetico per cinque minuti.
Quindi aspirare il liquido limpido e scartare. Aspirare il liquido rimanente utilizzando una punta da 10 microliter. Aggiungere 200 microlitri di 80%etanolo a ciascun campione e incubare per 30 secondi.
Aspira 195 microlitri di etanolo e scarta. Quindi aspirare il liquido rimanente utilizzando una punta da 10 microliter. Ripetere il lavaggio dell'etanolo.
Quindi aprire i tappi dei tubi e lasciarli asciugare all'aria per cinque minuti. Dopo cinque minuti, rimuovere i campioni dal supporto magnetico e aggiungere 25 microlitri di tampone di eluizione. Mescolare con pipettazione fino a omogenea e incubare a temperatura ambiente per due minuti.
Posizionare i tubi sul supporto magnetico per cinque minuti. Quindi trasferire 22 microlitri su un nuovo tubo PCR e misurare la concentrazione di DNA. Quantificare l'amplicon come descritto nel manoscritto testuale.
Dopo aver calcolato la concentrazione finale del DNA e la dimensione in coppie di basi del picco del prodotto, preparare un nuovo mix di diluizione per ogni campione e trasferirvi due microlitri in un nuovo mix di pool. Preparare una soluzione fresca di idrossido di sodio normale 0,2 e aggiungere 10 microlitri alla libreria diluita. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per denaturare il DNA a doppio filamento.
Quindi aggiungere 980 microlitri di tampone pre-refrigerato dal kit al tubo contenente DNA e vortice brevemente. Caricare 600 microlitri della libreria finale sulla cartuccia designata e posizionare i campioni nella macchina. Per eseguire l'analisi di sequenziamento, scaricare le metriche di sequenziamento dal sequencer e verificare che i dati si trovano all'interno degli intervalli appropriati.
Ripetere l'esecuzione per i campioni che non soddisfano i criteri. Questo protocollo è stato utilizzato per eseguire un'analisi di base di campioni rappresentativi di sangue autologo e rettale di un paziente con carenza del recettore IL10 e una storia di grave IBD ad esordio infantile. I campioni sono stati analizzati sia per il repertorio TCR-beta che per quello IGH.
Tutti i cloni possono essere identificati dalla loro sequenza unica a livello nucleotidico o amminoacido. Queste sequenze possono essere confrontate tra diversi pazienti alla ricerca di cloni condivisi o nello stesso paziente tra diversi siti anatomici. I cinque cloni più frequenti per ogni campione sono mostrati qui.
Le immagini TreeMap sono state generate per un'ampia panoramica del repertorio. Ogni quadrato colorato rappresenta un clone diverso e la dimensione è correlata alla sua frequenza. Queste immagini TreeMap dimostrano l'espansione clonale nel repertorio intestinale IGH.
Al contrario, nel repertorio TCR-beta, si osserva una marcata espansione clonale nel sangue rispetto all'intestino autologo. A livello genico, NGS fornisce informazioni sull'uso di V, D e J a livello di gene, famiglia o allele. Inoltre, combinazioni VDJ specifiche possono essere dedotte dai dati per i repertori TCR-beta e IGH, rivelando modelli di utilizzo genico differenziale in varie condizioni.
Questo protocollo può essere applicato sia sul DNA che sull'RNA e può essere utilizzato per generare repertori TCR-alfa, TCR-gamma e IGL. È anche compatibile con altri organi dopo lievi modifiche alla digestione.
