この方法は、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで特定のTおよびB細胞を探索し、したがって、異なる障害におけるリンパ球集団および多様性パラメータの動的変化を同定することができる。次世代シーケンシングの利点は、ユニークなTまたはB細胞クローンを同定し、異なる解剖学的部位または異なる個体でそれらを追跡する能力です。これは、多様な疾患における新しいバイオマーカーの同定の可能性を秘めています。
その手順を実証するのは、私の研究室の研究助手であるナオミ・サラモンです。まず、腸内生検の消化と細胞のリシスを行う。腸内生検を取り出す、新鮮な収集または負の20または負の80°Cで保存します。
凍結生検を使用する場合は、氷の上でそれらを解凍します。氷の上で冷やした無菌1.7ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに600マイクロリットルの核溶解溶液を加えます。その後、生検をチューブに入れ、摂氏65度で15〜30分間インキュベートします。
10ミリグラム/ミリリットルプロテイナーゼKの17.5マイクロリットルを加え、穏やかな揺れで摂氏55度で一晩チューブをインキュベートします。インキュベーション後、試料を室温まで5分間冷却します。血液からのDNA分離のために、チューブが完全に混合されるまでチューブを穏やかに揺らす。
その後、9ミリリットルの細胞溶解溶液を含む無菌15ミリリットル遠心分離管に血液を移す。室温で10分間のインキュベーション期間中にチューブを数回反転させます。室温で10分間600gで遠心分離機。
その後、可視の白いペレットを邪魔することなく、できるだけ多くの上清を捨てます。完全に再懸濁されるまで15秒間チューブを激しく渦盛り。3ミリリットルの核溶解溶液を加え、ピペットを数回加え、粘性になる。
サンプルにタンパク質沈殿バッファーを加えます。その後、20秒間激しく渦を流し、氷の上で5分間インキュベートします。遠心分離機を16,000gで4分間、沈殿したタンパク質を含むタイトペレットを形成した。
慎重に新しい1.7ミリリットルのチューブにペレットを邪魔することなく上清を移動します。上清を含むチューブに2-プロパノールの1ミリリットルを加え、反転させて軽く混ぜます。DNAは白い浮遊物質として見えるようになるはずです。
16,000回gで遠心分離機を1分間、上清を完全に取り除いた。作りたての70%エタノールを1ミリリットル加え、チューブを数回反転させます。室温で1分16,000gで遠心分離します。
その後、上清を慎重に捨てます。エタノール洗浄を繰り返します。その後、DNAペレットを10〜15分間空気乾燥させます。
DNAに50マイクロリットルの超純水を加え、テキスト原稿に記載されているようにDNA定量を行う。150ナノグラムのDNAを使用して、シーケンシング用のライブラリを準備します。残存DNAを分解するために15分間UVライトでフードにピペットとチップを入れます。
一方、異なるインデックスチューブとDNAポリメラーゼが氷の上で解凍することを可能にする。生物学的フードでは、異なるインデックスチューブから45マイクロリットルをPCRチューブに加えて、クロスコンタミネーションを避けるように注意してください。その後、0.2マイクロリットルのDNAポリメラーゼと調製したDNAの5マイクロリットルをPCRチューブに加えます。
メーカーの指示に従って、プリセットプログラムを使用してPCRを実行します。過剰なプライマー、ヌクレオチド、酵素の除去には、磁気ビーズを使用してください。ビーズを室温まで少なくとも30分間温め、サンプルあたり400マイクロリットルに対して80%エタノールを十分に新鮮に調製します。
各PCRチューブにビーズを加え、10回ピペットで混ぜます。室温で10分間チューブをインキュベートします。混合サンプルを磁気スタンドに5分間置きます。
その後、透明な液体を吸引し、廃棄する。残りの液体を10マイクロリットルの先端を使用して吸引する。各サンプルに200マイクロリットルの80%エタノールを加え、30秒間インキュベートします。
195マイクロリットルのエタノールを吸引し、廃棄する。その後、残りの液体を10マイクロリットルの先端を使用して吸引する。エタノール洗浄を繰り返します。
その後、チューブのキャップを開け、5分間空気乾燥させます。5分後、磁気スタンドからサンプルを取り出し、溶出バッファーを25マイクロリットル加えます。均質になるまでピペットで混ぜ、室温で2分間インキュベートする。
チューブを磁気スタンドに5分間置きます。次いで、22マイクロリットルを新しいPCRチューブに移し、DNA濃度を測定します。テキスト原稿に記載されているアンプリコンを定量化します。
製品のピークの塩基対の最終的なDNA濃度とサイズを計算した後、各サンプルに新しい希釈ミックスを準備し、その2マイクロリットルを新しいプールミックスに移します。0.2通常の水酸化ナトリウムの新鮮な溶液を調製し、希釈されたライブラリに10マイクロリットルを加えます。二本鎖DNAを変性させるために室温で5分間インキュベートする。
次に、キットから980マイクロリットルのプレチルドバッファーをDNAを含むチューブに加え、渦を短時間加えます。最終ライブラリの600マイクロリットルを指定されたカートリッジに積み込み、サンプルを機械に入れます。シーケンス分析を実行するには、シーケンシング・メトリックをシーケンサーからダウンロードし、データが適切な範囲内にあるかどうかを確認します。
基準を満たしていないサンプルに対して実行を繰り返します。このプロトコルは、IL10受容体欠損症の患者の代表的な自家血および直腸サンプルの基礎分析および重度の乳児発症IBDの歴史を実行するために使用された。TCR-βおよびIGHレパートリーの両方についてサンプルをアッセイした。
すべてのクローンは、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルでのそれらのユニークな配列によって同定することができる。これらの配列は、共有クローンを探索する場合、または異なる解剖学的部位間の同じ患者で異なる患者間で比較することができる。各サンプルの最も頻繁な 5 つのクローンを次に示します。
レパートリーの概要を示すツリーマップ画像が生成されました。色付きの正方形はそれぞれ異なるクローンを表し、サイズはその頻度と相関します。これらのTreeMap画像は、腸管IGHレパートリーのクローン拡張を示す。
これに対し、TCR-βレパートリーでは、自家の腸に比べて血中に顕著なクローン拡張が認められる。遺伝子レベルでは、NGSは、遺伝子、家族、または対立遺伝子のレベルでV、D、およびJの使用に関する情報を提供します。さらに、TCR-βとIGHレパートリーのデータから特定のVDJの組み合わせを推測することができ、様々な条件での遺伝子の差動パターンを明らかにする。
このプロトコルは、DNAとRNAの両方に適用することができ、TCR-α、TCR-γ、およびIGLレパートリーを生成するために使用することができます。また、わずかな消化修飾後に他の臓器と互換性があります。
