这种方法能够在核苷酸或氨基酸水平上探索特定的T和B细胞，从而能够识别淋巴细胞种群的动态变化和不同疾病的多样性参数。下一代测序的优点是能够识别独特的T或B细胞克隆，并在不同的解剖部位或不同的个体中跟踪它们。这有可能在各种疾病中识别新的生物标志物。
证明这一程序的将是娜奥米萨拉蒙，从我的实验室的研究助理。首先进行肠道活检的消化和细胞裂解。检索肠道活检，无论是新收集的，或储存在负20或负80摄氏度。
如果使用冷冻活检，在冰上解冻。在冰上冷却的无菌1.7毫升微中微管中加入600微升核裂解溶液。然后将活检放入管中，在65摄氏度下孵育15至30分钟。
加入17.5微升每毫升蛋白质酶K，并在55摄氏度下连夜孵育管子，轻轻摇晃。孵化后，让样品冷却到室温五分钟。要使DNA与血液分离，轻轻摇动管子，直到它完全混合。
然后将血液转移到含有9毫升细胞裂解溶液的无菌15毫升离心机管。在室温下10分钟的潜伏期内多次倒置管子。离心机在室温下600克，10分钟。
然后丢弃尽可能多的超自然，而不会干扰可见的白色颗粒。大力涡流管15秒，直到完全恢复。加入三毫升核裂解溶液，并多次使用移液器，使溶液变粘。
在样品中添加蛋白质沉淀缓冲区。然后大力旋转20秒，在冰上孵育5分钟。离心机在16，000克，为期四分钟，形成一个紧密的颗粒，含有沉淀的蛋白质。
小心地将超细剂转移，而不会干扰颗粒到新的 1.7 毫升管。将一毫升的二丙醇加入含有超自然剂的管子中，然后通过倒置轻轻混合。DNA应该变成白色漂浮物质可见。
离心机在16，000倍g一分钟，并完全删除超母体。加入一毫升新制备的70%乙醇，并倒置管子几次。在室温下以16，000克的速度离心一分钟。
然后小心地丢弃超自然人。重复洗乙醇。然后让DNA颗粒风干10到15分钟。
在DNA中加入50微升超纯水，并按文本手稿描述进行DNA定量。使用 150 毫微克的 DNA 来准备库进行测序。将移液器和尖端与紫外线一起放在引擎盖中15分钟，以分解残余DNA。
同时，允许不同的索引管和DNA聚合酶在冰上解冻。在生物罩中，从不同的索引管中加入 45 微升到 PCR 管中，注意避免交叉污染。然后将 0.2 微升脱氧核糖核酸聚合酶和 5 微升制备脱氧核糖核酸加入 PCR 管中。
根据制造商的说明使用预设程序运行 PCR。使用磁珠去除多余的引物、核苷酸和酶。将珠子加热至室温至少30分钟，并准备足够的新鲜80%乙醇，每个样品400微升。
将珠子添加到每个 PCR 管中，通过管道混合 10 次。在室温下将管子孵化10分钟。将混合样品放在磁性支架上五分钟。
然后吸气清澈的液体，然后丢弃。使用 10 微升尖吸气剩余的液体。在每个样品中加入200微升80%乙醇，孵育30秒。
吸气195微升乙醇，然后丢弃。然后使用 10 微升尖吸气剩余的液体。重复洗乙醇。
然后打开管子的盖子，让它们风干五分钟。五分钟后，从磁性支架中取出样品，并加入 25 微升的洗脱缓冲器。通过管道混合至均匀，并在室温下孵育两分钟。
将管子放在磁性支架上五分钟。然后将22微升转到新的PCR管中，并测量DNA浓度。量化文本手稿中描述的放大。
在计算了产品峰值的最终 DNA 浓度和碱基对的大小后，为每个样品准备一个新的稀释组合，并将其中的两个微升转移到一个新的池组合中。准备0.2普通氢氧化钠的新鲜溶液，并在稀释后的库中加入10微升。在室温下孵化五分钟，以去除双链DNA。
然后将 980 微升预冷缓冲器从试剂盒添加到含有 DNA 的管中，并短暂地漩涡。将最终库的 600 微升装载到指定的墨盒上，并将样品放在机器中。要执行测序分析，请从测序器下载测序指标，并验证数据是否在适当的范围内。
重复运行不符合标准的样品。该协议用于对IL10受体缺乏患者的代表性自体血液和直肠样本以及严重婴儿发病IBD史进行基本分析。对TCR-测试版和IGH剧目都进行了检测。
所有克隆都可以通过核苷酸或氨基酸水平的独特序列来识别。这些序列可以在不同的患者之间进行比较，以寻找共享的克隆，也可以在不同解剖部位的同一患者之间进行比较。此处显示了每个样本最常出现的五个克隆。
生成树图图像是为了全面概述剧目。每个彩色方块表示不同的克隆，其大小与其频率相关。这些树图图像显示肠道IGH剧目中的克隆扩张。
相比之下，在TCR-β剧目中，与自体肠相比，血液中观察到明显的克隆扩张。在基因水平上，NGS 提供有关 V、D 和 J 使用的信息，其级别为基因、家族或等位基因。此外，可以从TCR-β和IGH剧目的数据中推断出特定的VDJ组合，揭示不同条件下的差异基因使用模式。
此协议可应用于 DNA 和 RNA，并可用于生成 TCR-阿尔法、TCR-伽马和 IGL 剧目。在稍作消化改性后，它也与其他器官兼容。
