تمكن هذه الطريقة من استكشاف خلايا T و B محددة على مستوى النيوكليوتيد أو الأحماض الأمينية وبالتالي يمكن تحديد التغيرات الديناميكية في مجموعات الخلايا الليمفاوية ومعلمات التنوع في اضطرابات مختلفة. وميزة تسلسل الجيل التالي هي القدرة على تحديد استنساخ الخلايا الفريدة من نوعها T أو B وتتبعها في مواقع تشريحية مختلفة أو في أفراد مختلفين. وهذا يمكن أن يؤدي إلى تحديد المؤشرات البيولوجية الجديدة في الأمراض المتنوعة.
إثبات هذا الإجراء سيكون نعومي سلامون، مساعدة باحثة من مختبري. تبدأ من خلال إجراء الهضم وتحلل الخلايا من خزعات الأمعاء. استرداد خزعات الأمعاء إما جمعت حديثا أو المخزنة في 20 السلبية أو 80 درجة مئوية سالبة.
إذا كنت تستخدم الخزعات المجمدة، إذابة لهم على الجليد. أضف 600 ميكرولتر من محلول تحلل النوى إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم 1.7 ملليلتر، مبرد على الجليد. ثم ضع خزعة في الأنبوب، واحتضانها في 65 درجة مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة.
إضافة 17.5 ميكرولتر من البروتين 20 ملليغرام لكل ملليلتر K، واحتضان الأنبوب بين عشية وضحاها في 55 درجة مئوية، مع اهتزاز لطيف. بعد الحضانة، اسمح للعينة أن تبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. لعزل الحمض النووي من الدم، هز بلطف الأنبوب حتى يتم خلطه تماما.
ثم نقل الدم إلى أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر معقمة تحتوي على تسعة ملليلتر من محلول تحلل الخلية. عكس الأنبوب عدة مرات خلال فترة حضانة مدتها 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. جهاز طرد مركزي في 600g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ثم تجاهل أكبر قدر ممكن من الناسخ دون إزعاج بيليه الأبيض مرئية. دوامة الأنبوب بقوة لمدة 15 ثانية حتى إعادة الإنفاق تماما. إضافة ثلاثة ملليلتر من محلول تحلل النوى، وماصة عدة مرات، مما تسبب في حل لتصبح لزجة.
إضافة البروتين هطول الأمطار العازلة للعينة. ثم دوامة بقوة لمدة 20 ثانية، واحتضانه على الجليد لمدة خمس دقائق. الطرد المركزي في 16, 000g لمدة أربع دقائق لتشكيل بيليه ضيق يحتوي على البروتينات عجلت.
نقل بعناية supernatant دون إزعاج بيليه إلى أنبوب جديد 1.7 ملليلتر. إضافة ملليلتر واحد من 2-بروبانول إلى الأنبوب الذي يحتوي على supernatant، ومزج بلطف عن طريق عكس. يجب أن يصبح الحمض النووي مرئيا كمادة عائمة بيضاء.
الطرد المركزي في 16، 000 مرة ز لمدة دقيقة واحدة، وإزالة supernatant تماما. إضافة ملليلتر واحد من الإيثانول الطازجة 70٪، وعكس الأنبوب عدة مرات. الطرد المركزي في 16، 000g لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
ثم تجاهل بعناية فائقة. كرر غسل الإيثانول. ثم اترك بيليه الحمض النووي لتجف الهواء لمدة 10 إلى 15 دقيقة.
أضف 50 ميكرولتر من المياه فائقة النقاء إلى الحمض النووي، وأجري عملية تحديد كمي للحمض النووي كما هو موضح في مخطوطة النص. استخدم 150 نانوجرام من الحمض النووي لإعداد المكتبة للتسلسل. ضع ماصة ونصائح في غطاء محرك السيارة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة لكسر الحمض النووي المتبقي.
وفي الوقت نفسه، اسمح لأنابيب المؤشر المختلفة وبلمرة الحمض النووي بالذوبان على الجليد. في غطاء محرك السيارة البيولوجي، أضف 45 ميكرولتر من أنابيب الفهرس المختلفة إلى أنابيب PCR، مع الحرص على تجنب التلوث المتبادل. ثم أضف 0.2 ميكرولتر من بوليمرات الحمض النووي وخمسة ميكرولترات من الحمض النووي المعد في أنابيب PCR.
تشغيل PCR باستخدام برنامج مسبقا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدام الخرز المغناطيسي لإزالة التمهيديات الزائدة، النيوكليوتيدات، والإنزيمات. قم بتدفئة الخرز إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل، واستعد ما يكفي من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ ل 400 ميكرولتر لكل عينة.
إضافة الخرز إلى كل أنبوب PCR، وتخلط عن طريق pipetting 10 مرات. احتضان الأنابيب لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع العينة المختلطة على الحامل المغناطيسي لمدة خمس دقائق.
ثم يستنشق السائل واضحة، وتجاهل. يستنشق السائل المتبقي باستخدام طرف 10 ميكرولتر. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ إلى كل عينة، واحتضن لمدة 30 ثانية.
أسبيرات 195 ميكرولتر من الإيثانول، والتخلص منها. ثم يستنشق السائل المتبقي باستخدام طرف 10 ميكرولتر. كرر غسل الإيثانول.
ثم افتح قبعات الأنابيب، ودعها تجف لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق، قم بإزالة العينات من الحامل المغناطيسي، وأضف 25 ميكرولتر من العازلة elution. تخلط عن طريق الأنابيب حتى متجانسة، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.
ضع الأنابيب على الحامل المغناطيسي لمدة خمس دقائق. ثم نقل 22 ميكرولتر إلى أنبوب PCR جديد، وقياس تركيز الحمض النووي. قياس أمبليكون كما هو موضح في المخطوطة النصية.
بعد حساب تركيز الحمض النووي النهائي والحجم في أزواج أساسية من ذروة المنتج ، قم بإعداد مزيج تخفيف جديد لكل عينة ، ونقل اثنين من الميكرويتر منه إلى مزيج جديد من المسبح. إعداد محلول جديد من هيدروكسيد الصوديوم العادي 0.2، وإضافة 10 ميكرولتر إلى المكتبة المخففة. احتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل.
ثم أضف 980 ميكرولتر من العازلة المبردة مسبقا من عدة إلى أنبوب يحتوي على الحمض النووي، ودوامة لفترة وجيزة. تحميل 600 ميكرولتر من المكتبة النهائية على خرطوشة المعينة، ووضع العينات في الجهاز. لإجراء تحليل التسلسل، قم بتنزيل مقاييس التسلسل من المنظم، وتحقق من أن البيانات موجودة ضمن النطاقات المناسبة.
كرر تشغيل العينات التي لا تفي بالمعايير. تم استخدام هذا البروتوكول لإجراء تحليل أساسي لعينات الدم المستقيم والتمثيلي لمريض يعاني من نقص مستقبلات IL10 وتاريخ من IBD الشديد عند ظهور الطفل. تم فحص العينات لكل من TCR-beta و IGH repertoire.
ويمكن تحديد جميع المستنسخين من خلال تسلسل فريد من نوعه على مستوى النيوكليوتيد أو الأحماض الأمينية. ويمكن مقارنة هذه التسلسلات بين المرضى مختلفة بحثا عن استنساخ المشتركة أو في نفس المريض بين مواقع تشريحية مختلفة. تظهر هنا الحيوانات المستنسخة الخمسة الأكثر تكرارا لكل عينة.
تم إنشاء صور TreeMap للحصول على نظرة عامة واسعة على المرجع. يمثل كل مربع ملون استنساخ مختلف، ويرتبط الحجم بتردده. توضح صور TreeMap هذه التوسع اللاستنساخي في ذخيرة IGH المعوية.
في المقابل ، في ذخيرة TCR-beta ، لوحظ توسع كلوي ملحوظ في الدم بالمقارنة مع الأمعاء الذاتية. على مستوى الجينات، تقدم NGS معلومات حول استخدام V و D و J على مستوى الجين أو العائلة أو الأليل. وعلاوة على ذلك، يمكن استنتاج تركيبات VDJ محددة من البيانات الخاصة بذخيرة TCR-beta و IGH، مما يكشف عن أنماط استخدام الجينات التفاضلية في ظروف مختلفة.
يمكن تطبيق هذا البروتوكول على كل من الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي ويمكن استخدامه لتوليد ذخيرة TCR-alpha و TCR-gamma و IGL. كما أنه متوافق مع الأعضاء الأخرى بعد تعديلات طفيفة في الهضم.
