Este método permite la exploración de células T y B específicas a nivel de nucleótidos o aminoácidos y, por lo tanto, puede identificar cambios dinámicos en las poblaciones de linfocitos y parámetros de diversidad en diferentes trastornos. La ventaja de la secuenciación de próxima generación es la capacidad de identificar clones únicos de células T o B y rastrearlos en diferentes sitios anatómicos o en diferentes individuos. Esto tiene el potencial para la identificación de nuevos biomarcadores en diversas enfermedades.
Demostrando ese procedimiento estará Naomi Salamon, una asistente de investigación de mi laboratorio. Comience por realizar la digestión y la lisis celular de las biopsias intestinales. Recupere biopsias intestinales recién recolectadas o almacenadas a 20 u 80 grados centígrados negativos.
Si usa biopsias congeladas, descongelarlas en hielo. Añadir 600 microlitros de solución de lisis de núcleos a un tubo estéril de microcentrífuga de 1,7 mililitros, refrigerado sobre hielo. Luego coloque una biopsia en el tubo e incubarlo a 65 grados Celsius durante 15 a 30 minutos.
Agregue 17.5 microlitros de 20 miligramos por mililitro proteinasa K, e incube el tubo durante la noche a 55 grados Celsius, con un temblor suave. Después de la incubación, deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente durante cinco minutos. Para el aislamiento del ADN de la sangre, mezcle suavemente el tubo hasta que se mezcle completamente.
Luego transfiera sangre a un tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros que contiene nueve mililitros de solución de lisis celular. Invierta el tubo varias veces durante un período de incubación de 10 minutos a temperatura ambiente. Centrífuga a 600g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Luego deseche tanto sobrenadante como sea posible sin molestar el pellet blanco visible. Vórtice el tubo vigorosamente durante 15 segundos hasta que se resuspended por completo. Agregue tres mililitros de solución de lisis de núcleos y pipetee varias veces, haciendo que la solución se vuelva viscosa.
Agregue tampón de precipitación de proteínas a la muestra. Luego vórtice vigorosamente durante 20 segundos, e incubarlo en hielo durante cinco minutos. Centrífuga a 16, 000g durante cuatro minutos para formar un pellet apretado que contiene las proteínas precipitadas.
Transfiera cuidadosamente el sobrenadante sin molestar el pellet a un nuevo tubo de 1.7 mililitros. Agregue un mililitro de 2-propanol al tubo que contiene el sobrenadante y mézclelo suavemente invirtiendo. El ADN debe hacerse visible como una sustancia flotante blanca.
Centrífuga a 16, 000 veces g durante un minuto, y retire el sobrenadante por completo. Agregue un mililitro de etanol al 70% recién preparado e invierta el tubo varias veces. Centrifugarlo a 16,000g durante un minuto a temperatura ambiente.
A continuación, deseche cuidadosamente el sobrenadante. Repita el lavado de etanol. Luego deje que el pellet de ADN se seque al aire durante 10 a 15 minutos.
Agregue 50 microlitros de agua ultra-pura al ADN y realice la cuantificación del ADN como se describe en el manuscrito del texto. Utilice 150 nanogramos de ADN para preparar la biblioteca para la secuenciación. Coloque pipetas y puntas en la campana con luz UV durante 15 minutos para descomponer el ADN residual.
Mientras tanto, permita que los diferentes tubos de índice y adn polimerasa se descongele en el hielo. En una campana biológica, agregue 45 microlitros de los diferentes tubos índice a los tubos de PCR, teniendo cuidado de evitar la contaminación cruzada. A continuación, agregue 0,2 microlitros de la ADN polimerasa y cinco microlitros del ADN preparado en los tubos de PCR.
Ejecute PCR utilizando un programa preestablecido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice perlas magnéticas para la eliminación del exceso de cebadores, nucleótidos y enzimas. Caliente las perlas a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos y prepare suficiente etanol fresco al 80% para 400 microlitros por muestra.
Agregue las perlas a cada tubo de PCR y mezcle pipeteando 10 veces. Incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente. Coloque la muestra mixta en el soporte magnético durante cinco minutos.
Luego aspire el líquido claro y deseche. Aspirar el líquido restante usando una punta de 10 microlitros. Agregue 200 microlitros de etanol al 80% a cada muestra e incube durante 30 segundos.
Aspirar 195 microlitros de etanol, y desechar. Luego aspire el líquido restante usando una punta de 10 microlitros. Repita el lavado de etanol.
Luego abra las tapas de los tubos y déjelos secar al aire durante cinco minutos. Después de cinco minutos, retire las muestras del soporte magnético y agregue 25 microlitros de tampón de elución. Mezclar mediante pipeteo hasta que sea homogéneo, e incubar a temperatura ambiente durante dos minutos.
Coloque los tubos en el soporte magnético durante cinco minutos. Luego transfiera 22 microlitros a un nuevo tubo de PCR y mida la concentración de ADN. Cuantifique el amplicon como se describe en el manuscrito del texto.
Después de calcular la concentración final de ADN y el tamaño en pares de bases del pico del producto, prepare una nueva mezcla de dilución para cada muestra y transfiera dos microlitros de la misma a una nueva mezcla de piscina. Prepare una solución fresca de 0,2 hidróxido de sodio normal y agregue 10 microlitros a la biblioteca diluida. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente para desnaturalizar el ADN de doble cadena.
Luego agregue 980 microlitros de tampón pre-refrigerado del kit al tubo que contiene ADN y vórtice brevemente. Cargue 600 microlitros de la biblioteca final en el cartucho designado y coloque las muestras en la máquina. Para realizar el análisis de secuenciación, descargue las métricas de secuenciación del secuenciador y compruebe que los datos están dentro de los intervalos adecuados.
Repita la ejecución para los ejemplos que no cumplen los criterios. Este protocolo fue utilizado para realizar un análisis básico de la sangre autóloga representativa y de las muestras rectales de un paciente con deficiencia del receptor IL10 y una historia del infantil-inicio severo IBD. Las muestras fueron probadas para el repertorio TCR-beta y IGH.
Todos los clones pueden ser identificados por su secuencia única a nivel de nucleótidos o aminoácidos. Estas secuencias se pueden comparar entre diferentes pacientes en busca de clones compartidos o en el mismo paciente entre diferentes sitios anatómicos. Los cinco clones más frecuentes para cada muestra se muestran aquí.
Se generaron imágenes de TreeMap para una amplia visión general del repertorio. Cada cuadrado de color representa un clon diferente, y el tamaño se correlaciona con su frecuencia. Estas imágenes de TreeMap demuestran la extensión clónica en el repertorio intestinal de IGH.
En cambio, en el repertorio TCR-beta, la extensión clónica marcada se observa en la sangre en comparación con el intestino autólogo. A nivel de genes, NGS proporciona información sobre el uso de V, D y J a nivel de cualquier gen, familia o alelo. Por otra parte, las combinaciones específicas de VDJ se pueden inferir de los datos para los repertorios TCR-beta y IGH, revelando patrones diferenciados del uso del gen en varias condiciones.
Este protocolo se puede aplicar en la DNA y el ARN y se puede utilizar para generar la TCR-alfa, la TCR-gamma, y los repertorios de IGL. También es compatible con otros órganos después de ligeras modificaciones de digestión.
