Diese Methode ermöglicht die Erforschung spezifischer T- und B-Zellen auf Nukleotid- oder Aminosäureebene und kann so dynamische Veränderungen in Lymphozytenpopulationen und Diversitätsparametern bei verschiedenen Erkrankungen identifizieren. Der Vorteil der Next-Generation-Sequenzierung ist die Fähigkeit, einzigartige T- oder B-Zellklone zu identifizieren und sie an verschiedenen anatomischen Stellen oder bei verschiedenen Individuen zu verfolgen. Dies hat das Potenzial, neuartige Biomarker bei verschiedenen Krankheiten zu identifizieren.
Dieses Verfahren wird Naomi Salamon, eine Forschungsassistentin aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie mit der Verdauung und Zelllyse von Darmbiopsien. Rufen Sie Darmbiopsien entweder frisch gesammelt oder bei negativen 20 oder negativen 80 Grad Celsius gelagert.
Wenn Sie gefrorene Biopsien verwenden, tauen Sie sie auf Eis auf. 600 Mikroliter Kernlyselösung in ein steriles 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen geben, das auf Eis gekühlt wird. Dann legen Sie eine Biopsie in die Röhre und inkubieren Sie sie bei 65 Grad Celsius für 15 bis 30 Minuten.
Fügen Sie 17,5 Mikroliter 20 Milligramm pro Milliliter Proteinase K hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen über Nacht bei 55 Grad Celsius unter sanftem Schütteln. Lassen Sie die Probe nach der Inkubation fünf Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen. Zur DNA-Isolierung aus dem Blut die Röhre vorsichtig schaukeln, bis sie gründlich gemischt ist.
Anschließend wird das Blut in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit neun Millilitern Zelllyselösung überführen. Kehren Sie das Röhrchen während einer 10-minütigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur mehrmals um. Zentrifuge bei 600g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Entsorgen Sie dann so viel Überstand wie möglich, ohne das sichtbare weiße Pellet zu stören. Wirbeln Sie das Rohr 15 Sekunden lang kräftig vor, bis es vollständig resuspendiert ist. Fügen Sie drei Milliliter Kernlyselösung hinzu und pipetetten Sie mehrmals, wodurch die Lösung viskos wird.
Fügen Sie der Probe einen Proteinfällungspuffer hinzu. Dann 20 Sekunden lang kräftig wirbeln und fünf Minuten lang auf Eis inkubieren. Zentrifuge bei 16.000 g für vier Minuten, um ein dichtes Pellet zu bilden, das die gefällten Proteine enthält.
Den Überstand vorsichtig ohne Störung des Pellets in ein neues 1,7-Milliliter-Rohr überführen. Fügen Sie einen Milliliter 2-Propanol in das Röhrchen mit dem Überstand hinzu und mischen Sie es vorsichtig durch Invertieren. Die DNA soll als weiße schwimmende Substanz sichtbar werden.
Zentrifuge bei 16.000 mal g für eine Minute und entfernen Sie den Überstand vollständig. Fügen Sie einen Milliliter frisch zubereitetes 70% Ethanol hinzu und kehren Sie das Röhrchen mehrmals um. Zentrifugieren Sie es bei 16.000g für eine Minute bei Raumtemperatur.
Dann verwerfen Sie vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie die Ethanolwäsche. Dann lassen Sie das DNA-Pellet für 10 bis 15 Minuten an der Luft trocknen.
Fügen Sie der DNA 50 Mikroliter hochreines Wasser hinzu und führen Sie eine DNA-Quantifizierung durch, wie im Textmanuskript beschrieben. Verwenden Sie 150 Nanogramm DNA, um die Bibliothek für die Sequenzierung vorzubereiten. Legen Sie Pipetten und Spitzen mit UV-Licht für 15 Minuten in die Haube, um Rest-DNA abzubauen.
Lassen Sie in der Zwischenzeit die verschiedenen Indexröhrchen und dna-Polymerase auf Eis auftauen. In einer biologischen Haube 45 Mikroliter aus den verschiedenen Indexröhrchen zu den PCR-Röhrchen geben, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Anschließend werden 0,2 Mikroliter der DNA-Polymerase und fünf Mikroliter der vorbereiteten DNA in die PCR-Röhrchen eingeschmischt.
Führen Sie die PCR mit einem voreingestellten Programm gemäß den Anweisungen des Herstellers aus. Verwenden Sie magnetische Perlen zur Entfernung von überschüssigen Primern, Nukleotiden und Enzymen. Erwärmen Sie die Perlen mindestens 30 Minuten lang auf Raumtemperatur und bereiten Sie genügend frisches 80% Ethanol für 400 Mikroliter pro Probe zu.
Fügen Sie die Perlen zu jedem PCR-Röhrchen hinzu und mischen Sie es 10 Mal durch Pipettieren. Inkubieren Sie die Röhrchen für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Legen Sie die gemischte Probe für fünf Minuten auf den Magnetständer.
Dann saugen Sie die klare Flüssigkeit an und entsorgen Sie sie. Saugen Sie die verbleibende Flüssigkeit mit einer 10-Mikroliter-Spitze an. Fügen Sie 200 Mikroliter 80% Ethanol zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie sie für 30 Sekunden.
195 Mikroliter Ethanol absaugen und entsorgen. Dann saugen Sie die verbleibende Flüssigkeit mit einer 10-Mikroliter-Spitze an. Wiederholen Sie die Ethanolwäsche.
Öffnen Sie dann die Kappen der Schläuche und lassen Sie sie fünf Minuten an der Luft trocknen. Nach fünf Minuten die Proben aus dem Magnetständer entfernen und 25 Mikroliter Elutionspuffer hinzufügen. Durch Pipettieren bis zum Homogenen mischen und bei Raumtemperatur zwei Minuten lang inkubieren.
Legen Sie die Röhren für fünf Minuten auf den Magnetständer. Dann 22 Mikroliter in eine neue PCR-Röhre übertragen und die DNA-Konzentration messen. Quantifizieren Sie das Amplicon wie im Textmanuskript beschrieben.
Nachdem Sie die endgültige DNA-Konzentration und die Größe des Peaks des Produkts in Basenpaaren berechnet haben, bereiten Sie für jede Probe eine neue Verdünnungsmischung vor und übertragen Sie zwei Mikroliter davon in eine neue Poolmischung. Bereiten Sie eine frische Lösung von 0,2 normalem Natriumhydroxid vor und fügen Sie 10 Mikroliter zur verdünnten Bibliothek hinzu. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die doppelsträngige DNA zu denaturieren.
Dann fügen Sie 980 Mikroliter vorgekühlten Puffer aus dem Kit in die Röhre mit DNA und Wirbel kurz hinzu. Legen Sie 600 Mikroliter der endgültigen Bibliothek auf die dafür vorgesehene Patrone und legen Sie die Proben in die Maschine. Um eine Sequenzanalyse durchzuführen, laden Sie Sequenzierungsmetriken vom Sequenzer herunter, und überprüfen Sie, ob sich die Daten innerhalb der entsprechenden Bereiche befinden.
Wiederholen Sie den Lauf für Beispiele, die die Kriterien nicht erfüllen. Dieses Protokoll wurde verwendet, um eine grundlegende Analyse von repräsentativen autologen Blut- und Rektalproben eines Patienten mit IL10-Rezeptormangel und einer Vorgeschichte von schwerer infantiler IBD durchzuführen. Die Proben wurden sowohl für das TCR-beta- als auch für das IGH-Repertoire untersucht.
Alle Klone können durch ihre einzigartige Sequenz auf Nukleotid- oder Aminosäureebene identifiziert werden. Diese Sequenzen können zwischen verschiedenen Patienten auf der Suche nach gemeinsamen Klonen oder im selben Patienten zwischen verschiedenen anatomischen Stellen verglichen werden. Die fünf häufigsten Klone für jedes Beispiel sind hier dargestellt.
Für einen breiten Überblick über das Repertoire wurden TreeMap-Bilder generiert. Jedes farbige Quadrat stellt einen anderen Klon dar, und die Größe korreliert mit seiner Häufigkeit. Diese TreeMap-Bilder zeigen die klonale Expansion im intestinalen IGH-Repertoire.
Im Gegensatz dazu wird im TCR-beta-Repertoire eine ausgeprägte klonale Expansion im Blut im Vergleich zum autologen Darm beobachtet. Auf Genebene liefert NGS Informationen über die Verwendung von V, D und J auf der Ebene von Gen, Familie oder Allel. Darüber hinaus können aus den Daten für TCR-beta- und IGH-Repertoires spezifische VDJ-Kombinationen abgeleitet werden, die differentielle Gennutzungsmuster unter verschiedenen Bedingungen aufdecken.
Dieses Protokoll kann sowohl auf DNA als auch auf RNA angewendet werden und kann verwendet werden, um TCR-alpha-, TCR-gamma- und IGL-Repertoires zu generieren. Es ist auch mit anderen Organen nach leichten Verdauungsmodifikationen kompatibel.
