이 프로토콜은 인간의 치과 상피 세포를 조달하기위한 향상된 방법을 보여줍니다. 절차 중에 집계 된 세포 펠릿을 식별하기가 어렵습니다. 손실 세포 인구를 방지하기 위해 상체를 다룰 때주의하십시오.
시작하려면, 영향 받은 세 번째 어금니의 수술 추출 도중 치과 여포를 수확하십시오. 세포 격리 절차를 시작하거나 3%페니실린 연쇄 절제술로 DPBS에서 섭씨 4도에 치과 여포를 저장하십시오. 치과 여포를 씻으려면 치과 여포를 핀셋으로 잡고 세척 튜브 1에 놓습니다.
부드럽게 10~ 15회 흔들어줍니다. 그것을 꺼내 튜브 2에 배치하십시오. 다시, 그것을 흔들어 10 받는 것 15 시간.
마지막으로, 그것을 꺼내 튜브 3에 배치 한 다음 흔들어. 세 번 세척 한 후, 60 밀리미터 문화 접시에 치과 여포를 놓습니다. 치과 여포가 펄피 또는 squishy 외관이 될 때까지 조직 가위로 조직을 다진다.
조직 손실을 최소화하기 위해 배양 접시의 작은 측면 섹션을 사용합니다. 콜라게나아제 타입 1과 프로테아제 용액 을 각각 15 밀리리터 원뿔형 튜브에 섞는다. 다진 조직을 15 밀리리터 원뿔관으로 옮은 다음 부드럽게 흔들어 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.
튜브에 0.05%의 트립신-EDTA의 5밀리리터를 추가합니다. 흔들어 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하세요. 각질 세포 혈청 프리 배지 및 10% 태아 소 혈청을 함유한 각질 세포 매질을 준비합니다.
새로운 50 밀리리터 원추형 튜브에 3밀리리터의 각질 세포 매질을 추가합니다. 이 튜브 위에 40 마이크로미터 스트레이너를 놓습니다. 다음으로, 10 밀리리터 세로지컬 파이펫으로 조직을 포함하는 튜브에서 상체를 흡인하고 여과기를 통과합니다.
수집된 서스펜션을 15밀리리터 원내 튜브로 옮는다. 튜브원심분리기를 제거하고 상체를 제거합니다. 그런 다음 케나티노사이클 세럼 프리 배지 의 3 밀리리터를 추가합니다.
원심 분리기는 3분 간 추가로 상신포를 제거합니다. 각질 세포 세럼이 없는 배지를 사용하여 단일 세포 인구를 60mm 배양 접시에 접시를 넣습니다. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소를 가습한 분위기에서 5밀리리터의 최종 부피로 문화 접시를 유지하십시오.
상피 형태를 가진 세포는 단하나 세포 인구를 도금 한 후에 7 10 일 안에 나타났습니다. 조약돌 모양의 상피 세포의 수는 출현 시에 1에서 10까지 구역 수색하고 세포는 시간이 지남에 따라 식민지로 확장되었습니다. 가장 중요한 단계는 치과 여포를 작은 입자로 다진 것입니다.
그것은 여포 조직에서 단일 세포의 분리를 향상. 중간 엽 세포는 인간의 치과 여포에서 분리 될 수 있습니다. 배양 환경을 포함하는 혈청은 중간엽 세포를 선택하고 단일 세포 집단에서 상피 성장을 억제합니다.
이 프로토콜은 인간의 치과 상피 세포를 조달하는 방법을 제공합니다. 치과 여포 유래 상피 세포는 치과 상피 - 중간 엽 상호 작용의 연구에 활용 될 수있다.
