Valutazione locomotoria del modello di malattia di Parkinson a base di zebrafish adulto indotto da 6-idrossidopamina

Riepilogo

Il presente protocollo descrive l'iniezione intracerebroventricolare (ICV) di zebrafish adulto con 6-idrossidopamina neurotossica (6-OHDA) al diencefalo ventrale (Dn) e la valutazione della compromissione e del successivo recupero del comportamento di nuoto postlesione utilizzando il test in vasca aperta, che è accompagnato da analisi utilizzando un software di tracciamento video.

Abstract

I limiti degli attuali trattamenti nel ritardare la perdita neuronale dopaminergica nella malattia di Parkinson (PD) aumentano la necessità di terapie alternative in grado di ripristinare questi neuroni. Molti sforzi sono attualmente diretti verso una migliore comprensione della neurorigenerazione utilizzando modelli preclinici in vivo . Questa capacità rigenerativa per l'autoriparazione è, tuttavia, inefficiente nei mammiferi. Gli animali non mammiferi come il pesce zebra sono così emersi come un eccellente modello neurorigenerativo grazie alla sua capacità di auto-rinnovarsi continuamente e di avere una stretta omologia cerebrale per gli esseri umani. Come parte dello sforzo per chiarire gli eventi cellulari coinvolti nella neurorigenerazione in vivo, abbiamo stabilito il modello pd a base di pesce zebra adulto indotto da 6-idrossidopamina (6-OHDA). Ciò è stato ottenuto attraverso la microiniezione intracerebroventricolare (ICV) ottimizzata di 99,96 mM 6-OHDA per ablare specificamente i neuroni dopaminergici (DpN) nel diencefalo ventrale (Dn) del cervello del pesce zebra. L'immunofluorescenza ha indicato oltre l'85% dell'ablazione di DpN al terzo giorno postlesion e il ripristino completo di DpN nel sito lesionato 30 giorni dopo la lesione. Il presente studio ha determinato la compromissione e il successivo recupero del comportamento di nuoto del pesce zebra a seguito della lesione utilizzando il test in campo aperto attraverso il quale sono stati quantificati due parametri, distanza percorsa (cm) e velocità media (cm / s). La locomozione è stata valutata analizzando le registrazioni dei singoli pesci di ciascun gruppo (n = 6) utilizzando un software di tracciamento video. I risultati hanno mostrato una significativa (p < 0,0001) riduzione della velocità (cm/ s) e della distanza percorsa (cm) del pesce zebra lesionato 3 giorni dopo la lesione rispetto allo sham. Il pesce zebra lesionato ha mostrato un pieno recupero del comportamento di nuoto 30 giorni dopo la lesione. I risultati attuali suggeriscono che il pesce zebra adulto lesionato 6-OHDA è un modello eccellente con qualità riproducibile per facilitare lo studio della neurorigenerazione nel PD. Studi futuri sui meccanismi alla base della neurorigenerazione e sui fattori intrinseci ed estrinseci che modulano il processo possono fornire importanti informazioni sulle nuove strategie di trattamento sostitutivo cellulare contro il PD.

Introduzione

Il morbo di Parkinson (PD), una malattia caratterizzata in modo distintivo da rigidità muscolare, tremore a riposo e bradicinesia, è la malattia neurologica in più rapida crescita al ^mondo1,2. Il rischio e la prevalenza di PD aumentano rapidamente con l'età, specialmente negli individui di età pari o superiore a 50 ^anni3. L'eziologia e la patogenesi del PD finora rimangono poco conosciute. Questo ha spesso lasciato l'insorgenza precoce del PD non diagnosticata. Allo stato attuale, la mancanza di dopamina e la perdita di neuroni dopaminergici (DpN) nei pazienti con PD sono fortemente leg....

Protocollo

Il presente studio è stato approvato dal Committee on Animal Research and Ethics (CARE), Universiti Technologi MARA (UiTM) [Numero di riferimento: UiTM CARE 346/2021, datato 7 maggio 2021].

NOTA: Sono stati ^{utilizzati i} protocolli ^{pubblicati22,25,26} per l'allevamento standard e il mantenimento del modello PD di zebrafish adulto 6-OHDA-lesionato. Gli esperimenti sono stati condotti con pesci zebra maschi adulti (Danio rerio) di età superiore ai cinque mesi con una lunghezza standardizzata di 3,2-3,7 cm.

1. ....

Risultati

Il presente esperimento ha valutato i cambiamenti nel comportamento di nuoto del pesce zebra adulto dopo la microiniezione ICV con 6-OHDA. La ragione per l'utilizzo di 6-OHDA come neurotossina di scelta era dovuta alla sua incapacità di attraversare la barriera emato-encefalica, che produceva un'ablazione specifica e mirata di DpN nell'area di interesse-diencefalo ventrale (Dn)¹⁶. La sottopopolazione DpN qui ha una somiglianza anatomica con la sottopopolazione DpN nella substantia nigra pars comp.......

Discussione

Il presente lavoro ha dimostrato con successo la valutazione locomotoria del modello di PD adulto a base di pesce zebra adulto indotto da 6-OHDA. L'intero esperimento ha coinvolto tre fasi principali: preparazioni di microiniezione pre-ICV, microiniezione ICV di zebrafish e valutazione locomotoria. Per garantire il sano recupero del pesce zebra adulto seguendo la procedura di microiniezione ICV e un buon risultato sperimentale, nel presente studio sono state raccomandate alcune buone pratiche per ogni fase.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
6-Hydroxydopamine (6-OHDA)	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	162957
Ascorbic acid	Thermo Fisher Scientific, California, USA	FKC#A/8882/53
Disposable pasteur pipette, 3 mL	Thermo Fisher Scientific, California, USA	FB55348
Microcentrifuge tube, 0.2 mL	Eppendorf, Hamburg, Germany	30124332
Nice conical flask, 100 mL	Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia	SumYau0200
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	P4417
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	S5761
Sodium chloride	Merck, Darmstadt, Germany	106404
Stereomicroscope	Nikon, Tokyo, Japan	SMZ745
Tricaine methanesulfonate (MS-222)	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	E10521
Equipment
ANY-maze software	Stoelting Co., Illinois, USA	-	version 7.0; video tracking software
Cubis II Micro Lab Balance	Sartorius, Göttingen, Germany	SE 2
FemtoJet IV microinjector	Eppendorf, Hamburg, Germany	5192000035
Femtotip II, sterile injection capillary	Eppendorf, Hamburg, Germany	5242957000
InjectMan 4 micromanipulator	Eppendorf, Hamburg, Germany	5192000027
LED Portable Lamp	MR. DIY, Selangor, Malaysia	9023251	20 mAh
PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips	Ted Pella, California, USA	5367-12NM
Shanda aquarium heater	Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia	SDH-228
Thermometer	Sera Precision, Heinsberg, Germany	52525
Video camera	Nikon, Tokyo, Japan	D3100