Avaliação locomotor de 6-Hidroxidopamina-induzido Modelo de Doença de Parkinson baseado em Zebrafish

Resumo

O presente protocolo descreve a injeção intracerebroventricular (ICV) de zebrafish adulto com neurotóxifo 6-hidroxydopamina (6-OHDA) no diencephalon ventral (Dn) e a avaliação do prejuízo e posterior recuperação da pós-colisão do comportamento de natação usando o teste do tanque aberto, que é acompanhado pela análise usando um software de rastreamento de vídeo.

Resumo

As limitações dos tratamentos atuais para retardar a perda neuronal dopaminérgica na doença de Parkinson (DP) aumentam a necessidade de terapias alternativas que possam restaurar esses neurônios. Atualmente, muito esforço é direcionado para uma melhor compreensão da neuroregeneração usando modelos in vivo pré-clínicos. Esta capacidade regenerativa para auto-reparação é, no entanto, ineficiente em mamíferos. Animais não mamíferos como o zebrafish emergiram como um excelente modelo neuroregenerativo devido à sua capacidade de se auto-renovar continuamente e ter uma homologia cerebral próxima aos humanos. Como parte do esforço para elucidar eventos celulares envolvidos na neuroregeneração in vivo, estabelecemos o modelo de DP baseado em zebrafish adulto induzido por 6-OHDA (6-OHDA). Isso foi conseguido através da microinjeção intracerebroventricular otimizada (ICV) de 99,96 mM 6-OHDA para especificamente ablate neurônios dopaminérgicos (DpN) no diencephalon ventral (Dn) do cérebro de zebrafish. A imunofluorescência indicou mais de 85% da ablação da DPN no terceiro dia de pós-seção e restauração total da DPN no local lesionado 30 dias de pós-estação. O presente estudo determinou o comprometimento e posterior recuperação do comportamento de natação de zebrafish após a lesão, utilizando-se o teste de campo aberto através do qual foram quantificados dois parâmetros, distância percorrida (cm) e velocidade média (cm/s). A locomoção foi avaliada pela análise das gravações de peixes individuais de cada grupo (n = 6) utilizando software de rastreamento de vídeo. Os achados mostraram uma redução significativa (p < 0,0001) na velocidade (cm/s) e distância percorrida (cm) de zebrafish lesionado 3 dias após a pós-lesão quando comparado com sham. O zebrafish lesionado apresentou recuperação completa do comportamento de natação 30 dias após a pós-seção. Os presentes achados sugerem que o zebrafish adulto lesado 6-OHDA é um excelente modelo com qualidade reprodutível para facilitar o estudo da neuroregeneração em PD. Estudos futuros sobre os mecanismos subjacentes à neuroregeneração, bem como fatores intrínsecos e extrínsecos que modulam o processo podem fornecer informações importantes sobre novas estratégias de tratamento de substituição celular contra a DP.

Introdução

A doença de Parkinson (DP), doença caracterizada pela rigidez muscular, tremor de repouso e bradiquinia, é a doença neurológica que mais cresce no ^mundo1,2. O risco e a prevalência da DP aumentam rapidamente com a idade, especialmente em indivíduos com 50 anos ou mais ^{de 3 anos}. A etiologia e a patogênese da DP até agora permanecem mal compreendidas. Isso muitas vezes deixou o início precoce do PD sem diagnóstico. Atualmente, a falta de dopamina e a perda de neurônios dopaminérgicos (DP) em pacientes com DP estão fortemente ligados à manifestação dos sintomas ^motores4. Capitalizando essa relação, vários tratamentos foram projetados para atuar diretamente como substituição de dopamina (ou seja, levodopa) ou para compensar a perda de DPN (ou seja, estimulação cerebral profunda). Embora esses tratamentos tragam benefícios sintomáticos, eles não modificam o curso deteriorado da ^doença5. Diante dessa fraqueza significativa, a terapia de reposição celular foi proposta. A eficácia dessa abordagem é, no entanto, inconsistente, dado os desafios da preparação do enxerto, controle do crescimento celular e instabilidade do fenótipo. A terapia de reposição celular, que havia levantado preocupações éticas, também representa o risco de induzir tumores cerebrais e reações imunológicas ^{indesejadas6,7}.

As limitações das estratégias terapêuticas atuais têm levado a uma maior ênfase na regeneração da DPN como abordagem potencial no tratamento da DP. A regeneração da DPN ou neuroregeneração tem emergido como um dos avanços promissores no manejo da DPP, não apenas devido ao seu potencial como novo método terapêutico, mas também como meios de compreender o mecanismo da ^{doença8, 9}. Esta abordagem se concentra na restauração da função neuronal através da diferenciação, migração e integração das células progenitoras existentes nos circuitos ^lesados10. Para explorar ainda mais a neuroregeneração, vários estudos in vivo foram realizados. Verificou-se que vertebrados como mamíferos, anfíbios e répteis geram novas células cerebrais após ^lesões11,12. Entre os vertebrados, os animais mamíferos são mais procurados dada a sua semelhança genética com os seres humanos. Os mamíferos, no entanto, apresentam uma capacidade reparativa limitada e precária no sistema nervoso central (SNC) que pode durar até a idade adulta após uma lesão ^cerebral13. Em geral, os mamíferos não são adequados como modelos animais para entender a neuroregeneração, dado que o baixo número de neurônios produzidos não será suficiente para restaurar circuitos neurais danificados observados em DP. Como tal, o modelo baseado em teleemst, especificamente em zebrafish, é muito favorecido por sua alta taxa de proliferação, capacidade de se auto-renovar continuamente e fechar a homologia cerebral com ^humanos14,15.

O zebrafish é mais comumente usado para estudar o movimento desordenado em ^PD16. O modelo PD à base de zebrafish é geralmente induzido por neurotoxinas, que incluem 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropyridina (MPTP) e 6-hidroxidopamina (6-OHDA)¹⁷. Embora eficaz em induzir perda específica de DPN e diminuição dos níveis de dopamina, os modelos baseados em MPTP não imitam de perto as condições da DP, uma vez que a perda de DPN não se restringe apenas ao ^CNS18. A incapacidade do 6-OHDA de atravessar a barreira hemencefálica restringiu seus efeitos em alterações celulares e funcionais dentro do cérebro quando é administrado intracranianamente em oposição a ^{intramuscularmente19}. A administração periférica do 6-OHDA causou uma redução global dos níveis de dopamina em todo o sistema ^nervoso20. Enquanto a administração do 6-OHDA no fluido cefalorraquidiano causou ablação da DPN em todo o ^CNS21, que não imita a condição vista em DP, pelo qual a perda de DPN ocorre especificamente na substantia nigra do cérebro humano. A administração do ICV de 6-OHDA, pelo contrário, induziu especificamente ablação significativa da DPN na área de Dn ventral no cérebro de zebrafish, que se assemelhava muito à substantia ^nigra22. Curiosamente, a recuperação da DPN foi relatada 30 dias após lesão induzida por 6 OHDA e esses neurônios sobreviveram ao longo da ^vida23,24. A recuperação funcional da DPN foi demonstrada por meio de uma avaliação locomotora de distância percorrida (cm) e velocidade média (cm/s) utilizando o modelo PD adulto induzido por zebrafish 6-OHDA^{, modelo22}.

Protocolo

O presente estudo foi aprovado pela Comissão de Pesquisa e Ética Animal (CARE), Universidade Technologi MARA (UiTM) [Referência nº: UiTM CARE 346/2021, com data de 7 de maio de 2021].

NOTA: Foram utilizados os protocolos publicados22,25,26 para a criação padrão e a manutenção do modelo de PD de zebrafish adulto de 6-OHDA. Foram realizados experimentos com zebrafish macho adulto (Danio rerio) com mais de cinco meses de idade com comprimento padronizado de 3,2-3,7 cm.

1. Manutenção de zebrafish e preparações de microinjeção pré-ICV

1. Mantenha o peixe em um reservatório de água aerado sob uma temperatura controlada de 28 ± 1,0 °C. Para a criação e manutenção de zebrafish, utilize água destilada mineralizada com sal marinho comercial (1 g/L) durante todo o ^{experimento27}.
2. Abriga um máximo de 25 peixes por tanque de 45 L ou um peixe por 1,8 L de água e expõe-os a um cronograma de 14h de luz e 10h de fotoperíodo escuro. Alimente os peixes pelo menos duas vezes por dia com pelotas de alimentos complementadas com vermes congelados.
3. Prepare uma solução concentrada de estoque de metanosefonato tricaine (MS-222) dissolvendo 2,5 g de MS-222 e 5 g de bicarbonato de sódio em 250 mL de água destilada. Diluir 2 mL de solução de estoque para produzir 200 mL de solução de anestesia de trabalho.
4. Prepare 99,96 mM de 6-OHDA dissolvendo primeiro 0,2 mg de ácido ascórbico em 1 mL de 0,9% c/v nacl filtrado estéril. Filtre a solução com filtro de 0,2 mícrons antes de adicionar 25 mg de 6-OHDA em forma de pó na solução. Prepare a solução fresca antes de cada injeção e armazene-a no escuro a 4 °C.
   ATENÇÃO: Use equipamentos de proteção individual adequados (ou seja, luvas, casaco de laboratório e máscara facial) e pratique boas práticas laboratoriais ao manusear os produtos químicos. Todos os manuseios dos produtos químicos devem ser feitos dentro de um armário de biossegurança.

2. Anestesização e injeção de ICV de zebrafish

1. Acelere o peixe por 24 horas para evitar a regurgitação durante a anestesia. Anestesiar o peixe imergindo-o em um recipiente contendo 0,01% c/v de solução MS-222 por aproximadamente 1 min ou até que todo o movimento muscular visível cesse.
2. Posicione o peixe anestesiado em uma esponja encharcada de água colocada sob um estereoscópio e molhe o peixe regularmente.
3. Identifique a posição para injeção com base na intersecção entre a sutura metopic (MS), a sutura coronal (SC) e a sutura sagital (SS) que conecta o crânio frontal e parietal do cérebro de zebrafish.
4. Faça um pequeno orifício de 1,0 ^mm2 de área usando uma agulha afiada de 27 G no crânio guiada pela posição anatômica específica no crânio do zebrafish (Figura 1A,B).
5. Abaixe o injetor microcapilar em um ângulo de 60° até atingir uma profundidade de 1.200 μm do teto craniano do crânio do zebrafish (Figura 1C). Pressione o limite Z para fixar a posição.
6. Defina a pressão inicial de injeção para 4000 hPa e pressão de compensação para 10 hPa. Defina a duração da injeção para 0,3 s. Abaixe a intensidade da injeção a cada injeção subsequente.
7. Injete 0,5 μL de neurotoxina 6-OHDA de 99,96 mM (ou 0,9% c/v soro fisiológico para o grupo de controle falso) e deixe o microcapilar descansar por 20 s. Continue molhando o peixe com água destilada durante todo o processo de injeção para evitar a secagem.
8. Remova lentamente o microcapilar e ressuscite o peixe sob água destilada. Coloque o peixe em um tanque de recuperação isolado e remova quaisquer distrações que possam potencialmente perturbar o processo de recuperação.
9. Lave o microcapilário antes da próxima injeção para limpar o bloqueio e certifique-se de que a intensidade da injeção é suficiente para produzir o volume desejado de 0,5 μL de 6-OHDA.

Figura 1: Local de injeção de neurotoxina, 6-OHDA. (A) O ponto de entrada microcaparar é guiado pela intersecção entre a sutura metopic (MS), a sutura coronal (SC) e a sutura sagital (SS) que conecta o crânio frontal e parietal do cérebro de zebrafish (vista do plano). (B) Um desenho esquemático (visão do plano) do crânio e cérebro de zebrafish mostra o microcapilário, que é baixado diretamente acima da habenula (Hab), e seu ponto de entrada na intersecção entre hemisférios. (C) Um desenho esquemático (seção sagital) do cérebro de zebrafish mostra o ângulo de injeção e profundidade de penetração. O ponto preto representa o local lesionado que está situado acima da área alvo, o diencephalon ventral. Abreviaturas: 6-OHDA: 6-hidroxidopamina, CS: sutura coronal, Dn: diencephalon, Hab: habenula, Hyp: hypothalamus, MS: metopic suture, OB: bulbo olfativo, POA: área preóptica, PT: tuberculum posterior, SS: sutura sagitaral, Tec: tectum, e Tel: teleencefalon. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Avaliação locomotor

NOTA: A avaliação locomotor de zebrafish (n = seis / grupo; sham vs lesioned) foi avaliada individualmente através do teste do tanque aberto utilizando protocolos ^{estabelecidos28,29} no terceiro dia e dia 30 lesão pós-6-OHDA.

1. Gravação de vídeo
   1. Coloque o tanque experimental (comprimento de 20 cm, largura 11,5 cm, altura de 13 cm) com suas paredes cobertas com papel branco em uma plataforma elevada (Figura 2A).
   2. Ilumine o tanque de baixo usando uma fonte de luz. Encha o tanque com água destilada (80%-90% cheia) e mantenha a temperatura em 28 ± 1,0 °C. Meça a temperatura usando um termômetro e regular-a usando um aquecedor de aquário comercial.
   3. Após um mínimo de 2 minutos de aclimatação, registre o comportamento de natação de peixes a partir de uma visão de plano no plano bidimensional (2D) da arena experimental usando uma câmera de vídeo por 5 min (Figura 2B). Para evitar inconsistência no comportamento de natação do anterior e último lote de gravações, não exceda a aclimatação em 10 ^min30.
   4. Analise os vídeos usando software de rastreamento de vídeo com o protocolo open-tank para aquisição de distância percorrida (cm) e velocidade média (cm/s) de cada assunto.

Figura 2: Configuração experimental de um teste de tanque aberto para avaliação do comportamento locomotor de zebrafish. (A) O tanque experimental (visão frontal) é colocado em uma plataforma elevada que é iluminada a partir de baixo. As quatro paredes do tanque estão cobertas com papel branco e as gravações são capturadas axialmente. A temperatura é medida por meio de um termômetro e regulada a 28 ± 1,0 °C usando um aquecedor de aquário comercial. (B) Captura de tela (exibição do plano) da gravação de vídeo capturada usando a configuração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Análise de dados
   1. Clique duas vezes no ícone para abrir o software de rastreamento de vídeo. Clique na guia Arquivo e selecione Criar novo experimento vazio. Isso permitirá que o usuário personalize os parâmetros do experimento de acordo com os objetivos da investigação.
   2. Clique na guia Protocolo , selecione Fontes de vídeo e clique em Adicionar nova fonte de vídeo. Clique na lista desistências disponíveis e selecione a opção Arquivo de vídeo . Isso solicitará o pop-up de navegação de arquivos a partir do qual as gravações de vídeo de interesse podem ser selecionadas.
   3. Clique no subtabto do aparelho e selecione o ícone Retangular para configurar o aparelho. Arraste o ícone retangular para cobrir toda a arena experimental. Defina a barra de escala em conformidade e insira o valor numérico da medição da escala utilizada no comprimento da seção régua. O presente experimento utilizou uma escala de 10 mm para o teste do tanque aberto.
   4. Defina a cor animal selecionando Os animais são mais escuros que o fundo do aparelho. Deixe as outras opções disponíveis no Rastreamento para as configurações padrão predefinidas.
   5. No subtabelecimento de Zonas , clique no aparelho desenhado anteriormente. Esta zona é definida como a zona padrão da qual a posição é a mesma para todos os testes.
   6. Selecione as seguintes opções em agendamento de testes e relatório de dados de teste: Duração do teste, distância total percorrida e velocidade média. Outros testes disponíveis na lista são opcionais e dependem do interesse investigativo do pesquisador.
   7. Na guia Experimentar , atribua os animais de acordo com seu grupo de teste digitando o nome do grupo na seção Nome e o número de animais por grupo na seção Número de Animais .
   8. Mude para guia Testes para executar o experimento. Clique no ícone Iniciar teste e aguarde até que todos os vídeos sejam analisados.
   9. Na guia Resultados , clique no ícone Exibir o ícone Exibir os dados locomotor no formulário de relatório de texto.

Resultados

O presente experimento avaliou as mudanças no comportamento adulto de natação de zebrafish após a microinjeção do ICV com 6-OHDA. A razão para o uso do 6-OHDA como a neurotoxina escolhida foi devido à sua incapacidade de atravessar a barreira hematoencefálica, que produziu ablação específica e direcionada de DPN na área de diencephalon de interesse-ventral (Dn)¹⁶. A subpopulação do DPN aqui tem semelhança anatômica com a subpopulação dpn na substantia nigra pars

Discussão

O presente trabalho demonstrou com sucesso a avaliação locomotor do modelo de DP baseado em zebrafish adulto induzido por 6 OHDA. Todo o experimento envolveu três passos principais: preparações de microinjeção pré-ICV, microinjeção de ICV de zebrafish e avaliação locomotor. Para garantir a recuperação saudável dos zebrafish adultos após o procedimento de microinjeção do ICV e o bom resultado experimental, algumas boas práticas para cada etapa foram recomendadas no presente estudo.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
6-Hydroxydopamine (6-OHDA)	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	162957
Ascorbic acid	Thermo Fisher Scientific, California, USA	FKC#A/8882/53
Disposable pasteur pipette, 3 mL	Thermo Fisher Scientific, California, USA	FB55348
Microcentrifuge tube, 0.2 mL	Eppendorf, Hamburg, Germany	30124332
Nice conical flask, 100 mL	Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia	SumYau0200
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	P4417
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	S5761
Sodium chloride	Merck, Darmstadt, Germany	106404
Stereomicroscope	Nikon, Tokyo, Japan	SMZ745
Tricaine methanesulfonate (MS-222)	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	E10521
Equipment
ANY-maze software	Stoelting Co., Illinois, USA	-	version 7.0; video tracking software
Cubis II Micro Lab Balance	Sartorius, Göttingen, Germany	SE 2
FemtoJet IV microinjector	Eppendorf, Hamburg, Germany	5192000035
Femtotip II, sterile injection capillary	Eppendorf, Hamburg, Germany	5242957000
InjectMan 4 micromanipulator	Eppendorf, Hamburg, Germany	5192000027
LED Portable Lamp	MR. DIY, Selangor, Malaysia	9023251	20 mAh
PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips	Ted Pella, California, USA	5367-12NM
Shanda aquarium heater	Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia	SDH-228
Thermometer	Sera Precision, Heinsberg, Germany	52525
Video camera	Nikon, Tokyo, Japan	D3100