Valutazione della risposta uditiva del tronco cerebrale nei cuccioli di pollo

Riepilogo

Abbiamo usato tecniche standard di risposta uditiva del tronco cerebrale (ABR) e le abbiamo applicate ai polli da cova, un modello aviario precoce per la funzione uditiva. Il protocollo delinea in dettaglio le tecniche di preparazione degli animali e di acquisizione ABR, con passaggi che potrebbero tradursi in altri modelli aviari o roditori.

Abstract

La risposta uditiva del tronco cerebrale (ABR) è un test inestimabile nell'audiologia clinica, negli animali non umani e nella ricerca umana. Nonostante l'uso diffuso di ABR nella misurazione della sincronia neurale uditiva e nella stima della sensibilità uditiva in altri sistemi modello di vertebrati, i metodi per la registrazione degli ABR nel pollo non sono stati riportati in quasi quattro decenni. I polli forniscono un robusto modello di ricerca animale perché il loro sistema uditivo è vicino alla maturazione funzionale durante le fasi embrionali tardive e le prime fasi di schiusa. Abbiamo dimostrato i metodi utilizzati per ottenere registrazioni ABR a uno o due canali utilizzando array di elettrodi ad ago subdermici nei cuccioli di pollo. Indipendentemente dalla configurazione della registrazione dell'elettrodo (ad esempio, il montaggio), le registrazioni ABR includevano 3-4 forme d'onda di picco positive entro i primi 6 ms di uno stimolo di clic sopra soglia. Le ampiezze della forma d'onda da picco a valle variavano da 2 a 11 μV a livelli ad alta intensità, con picchi positivi che mostravano funzioni di latenza-intensità previste (cioè aumento della latenza in funzione della diminuzione dell'intensità). La posizione standardizzata degli auricolari è stata fondamentale per registrazioni ottimali poiché la pelle sciolta può occludere il condotto uditivo e il movimento degli animali può rimuovere il trasduttore di stimolo. Le ampiezze di picco erano più piccole e le latenze erano più lunghe quando la temperatura corporea degli animali si abbassava, sostenendo la necessità di mantenere la temperatura corporea fisiologica. Per i giovani piccoli (<3 ore dopo il giorno 1), le soglie sono state elevate di ~ 5 dB, le latenze di picco sono aumentate di ~ 1-2 ms e le ampiezze da picco a minimo sono diminuite di ~ 1 μV rispetto ai piccoli più anziani. Ciò suggerisce un potenziale problema correlato alla conduttiva (cioè fluido nella cavità dell'orecchio medio) e dovrebbe essere considerato per i giovani piccoli. Nel complesso, i metodi ABR qui descritti consentono una registrazione accurata e riproducibile della funzione uditiva in vivo nei cuccioli di pollo che potrebbe essere applicata a diversi stadi di sviluppo. Tali risultati sono facilmente confrontabili con modelli umani e mammiferi di perdita dell'udito, invecchiamento o altre manipolazioni uditive.

Introduzione

Lo studio delle risposte neurali evocate agli stimoli sonori risale a oltre mezzo secolo^{fa 1}. La risposta uditiva del tronco cerebrale (ABR) è un potenziale evocato che è stato utilizzato come misura della funzione uditiva sia negli animali non umani che negli esseri umani per decenni. L'ABR umano presenta da cinque a sette picchi di forma d'onda convenzionalmente etichettati da numeri romani (I-VII)². Questi picchi vengono analizzati in base alla loro latenza (tempo di occorrenza in millisecondi) e all'ampiezza (dimensione da picco a minimo in microvolt) delle risposte neurali. L'ABR è strumentale nella valutazione della funzione e dell'integrità del nervo uditivo, nonché della sensibilità del tronco cerebrale e della soglia uditiva. I deficit nel sistema uditivo provocano latenze e ampiezze ABR assenti, ridotte, prolungate o anormali. Sorprendentemente, questi parametri sono quasi identici negli esseri umani e in altri animali, rendendolo un test obiettivo coerente della funzione uditiva tra i modelli di vertebrati³.

Uno di questi sistemi modello è il pollo, ed è particolarmente utile per una serie di motivi. Gli uccelli possono essere classificati come altriciali o precoci⁴. Gli uccelli altricial si schiudono con i sensi ancora in via di sviluppo; ad esempio, i barbagianni non mostrano un ABR coerente fino a quattro giorni dopo il portello⁵. Animali precoci come il pollaio si schiudono con sensi quasi maturi. L'insorgenza dell'udito avviene nello sviluppo embrionale, in modo tale che giorni prima della schiusa (giorno embrionale 21), il sistema uditivo è vicino alla maturazione funzionale ^6,7,8. Gli uccelli altriciali e la maggior parte dei modelli di mammiferi sono suscettibili a fattori estrinseci che influenzano lo sviluppo e richiedono la zootecnia fino a quando l'udito non è maturo. Gli ABR di pollo possono essere eseguiti lo stesso giorno del portello, rinunciando alla necessità di alimentazione o di un ambiente arricchito.

Il pollo embrionale è stato un modello ben studiato per la fisiologia e lo sviluppo, specialmente nel tronco cerebrale uditivo. Strutture specifiche includono il nucleo cocleare di pollo, diviso in nucleo magnocellularis (NM) e nucleo angolare (NA), e il correlato aviario dell'oliva superiore mediale noto come nucleo laminare (NL)^6,7. L'ABR è ideale per concentrarsi sulla funzione uditiva centrale prima del livello del proencefalo e della corteccia. La traduzione tra misurazioni ABR in vivo e studi neuronali in vitro dello sviluppo⁸, fisiologia⁹, tonotopia¹⁰ e genetica^11,12 offre opportunità di ricerca ideali che supportano gli studi sulla funzione uditiva complessiva.

Sebbene l'ABR sia stato ampiamente studiato in modelli di mammiferi, c'è stata meno attenzione per gli avi. Precedenti studi aviari ABR includono caratterizzazioni del pappagallino¹³, picchio 14, gabbiano¹⁵, uccelli subacquei¹⁶, fringuello zebra¹⁷, rapaci diurni¹⁸, canarino¹⁹, tre specie di gufo ^5,20,21,22 e pollo²³. Dati i quasi quattro decenni trascorsi dall'ultima caratterizzazione approfondita del pollo ABR, molte delle attrezzature e delle tecniche precedentemente utilizzate sono cambiate. Le intuizioni di studi in altri modelli aviari possono aiutare a sviluppare la moderna metodologia ABR del pollo, fungendo anche da confronto con l'ABR di pollo. Questo documento delineerà la configurazione sperimentale e la progettazione per consentire la registrazione ABR nei polli da cova che potrebbero anche essere applicati a stadi embrionali di sviluppo e altri piccoli modelli di roditori e aviari. Inoltre, dato lo sviluppo precoce del pollo, le manipolazioni dello sviluppo possono essere eseguite senza alcuna ampia zootecnia. Le manipolazioni di un embrione in via di sviluppo possono essere valutate solo poche ore dopo che l'animale si schiude con capacità uditive quasi mature.

Protocollo

Gli esperimenti qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) della Northwestern University e condotti in conformità con la National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Allevamento di polli

1. Acquisisci uova di gallina livorno bianche fecondate.
   NOTA: Ci sono diverse razze di pollo utilizzate nella ricerca scientifica, ma i risultati mostrati qui provengono dal pollo livornese bianco (Gallus gallus domesticus). Mentre la variabilità ABR tra le razze è sconosciuta, alcune differenze sono state trovate quando si confrontano i polli adulti che depongono le uova con i polli da carne che producono carne^24,25.
2. Incubare le uova a 38 °C, umidità al 50%, per 21 giorni prima della data di prova desiderata.
   NOTA: Se le uova non vengono immediatamente incubate a 38 °C, possono essere conservate a 14 °C, umidità al 40%. Tuttavia, più a lungo le uova vengono mantenute a 14 °C, meno è probabile che si sviluppino in cuccioli vitali. Dopo 7 giorni, la vitalità delle uova può scendere fino al 50% a seconda di quanto tempo le uova vengono conservate a 14 °C. La vitalità delle uova diminuirà anche nei mesi invernali.
3. Gira periodicamente le uova 2-3 volte al giorno. La maggior parte degli incubatori ha un meccanismo per eseguire questo automaticamente.
4. Se si utilizza un'incubatrice di polistirolo o un'incubatrice contenente più di 6 uova, trasferire le uova in un piccolo incubatore a 38 °C il giorno prima della schiusa, il giorno embrionale 20 (E20). Le uova dovrebbero schiudersi 21 giorni (E21) dopo essere state messe nell'incubatrice.
   NOTA: Nel processo di schiusa, l'animale inizierà a "pipping" fuori dall'uovo, facendo un piccolo buco che alla fine gira intorno all'intero uovo. Se le condizioni sono troppo asciutte, l'uovo può asciugarsi e l'animale non sarà in grado di schiudersi. L'umidità deve essere mantenuta intorno al 50%, sulla base di studi precedenti sulla vitalità della schiusa delle uova 26,27,28,29.
5. Determina l'età dell'animale. Se il portello non è testimoniato di persona, l'unica indicazione dell'età sono le 2-3 ore necessarie affinché il liquido amniotico si asciughi.
   NOTA: L'incubatrice da cova deve essere accuratamente pulita quotidianamente con alcool isopropilico al 70% in base al numero di piccoli che vengono lavorati. I piccoli di pollo spesso lasciano escrementi, piume e liquido amniotico nell'incubatrice, che possono contaminare le condizioni e la qualità dell'aria.

2. Preparazione del farmaco

1. Pesare l'animale mettendolo in una grande barca di pesatura. Con un posizionamento abbastanza delicato, l'animale non dovrebbe muoversi.
   NOTA: la massa può variare da 30-45 g. Gli animali più giovani sono spesso più pesanti a causa delle riserve di tuorlo e non ancora espellono i rifiuti. Gli animali più anziani che si avvicinano alle 24 ore di età e P2 di solito pesano meno.
2. Preparare un cocktail anestetico di ketamina (100 mg / mL) e xilazina (20 mg / mL) in modo tale che il dosaggio sia di 50 mg / kg ketamina e 16,68 mg / kg di xilazina in base al peso animale.
   NOTA: Questo cocktail di farmaci può essere preparato con 1 mL di ketamina (100 mg / mL), 1,5 mL di xilazina (20 mg / mL) e 2,5 mL di H₂O. Le iniezioni di cocktail anestetici varieranno da 0,05-0,1 mL in base all'intervallo 30-45 g di peso animale.

3. Iniezione di farmaci e preparazione degli animali

1. Tieni l'animale in una mano, assicurandoti di tenere le gambe verso il basso.
2. Senti per lo sterno dell'animale, la chiglia. Su entrambi i lati della chiglia ci sarà il muscolo del seno.
3. Utilizzare un ago da 29 G e una siringa per penetrare 5 mm nella pelle e iniettare il cocktail ketamina/xilazina nel muscolo mammario. Iniettare tra 0,05-0,1 ml in base al peso dell'animale.
4. Riposizionare l'animale nell'incubatrice dopo l'iniezione. Mantenere la temperatura corporea animale per alcuni minuti mentre l'anestetico ha effetto.
   1. Usa una pinza per pizzicare la punta dell'animale e controlla se il collo è zoppicante. Se non c'è riflesso e un collo zoppicante, l'animale è incosciente.
5. Determina il sesso del pollo usando le sue piume alari. Se le piume sono tutte della stessa lunghezza, l'animale è maschio. Se le piume variano in lunghezza, l'animale è femmina³⁰.
   NOTA: Un altro metodo di sexing dell'animale è lo sfogo. I genitali maschili possono essere visti nella cloaca³¹. Questo metodo è molto difficile e può danneggiare l'animale se non fatto correttamente. Si consiglia di utilizzare il metodo della piuma d'ala.
6. Applicare la crema depilatoria con un applicatore di punta di cotone sulla zona della testa e del collo, in particolare vicino all'apertura dell'orecchio per l'uccello.
7. Utilizzare salviette alcool isopropilico al 70% per pulire le piume, l'eventuale crema depilatoria rimanente e la pelle della testa e del collo.
8. Utilizzare una salvietta alcool isopropilico al 70% per sterilizzare gli elettrodi sottodermici e la sonda rettale.
9. Posizionare l'animale in una camera di isolamento acustico e schermata elettricamente. Assicurarsi che l'ambiente abbia un rumore elettrico e acustico minimo per le migliori registrazioni.
   NOTA: Gli esperimenti qui sono stati fatti in un involucro isolato dal suono personalizzato che misura 24 x 24 x 25 pollici. Qualsiasi camera o stanza che elimini il rumore acustico, così come il rumore elettrico da corrente elettrica alternata (60 Hz negli Stati Uniti), è sufficiente.
10. Utilizzare una piastra riscaldante o un sistema di controllo della temperatura per mantenere la temperatura corporea degli animali.
11. Inserire la sonda rettale lubrificata per garantire che la temperatura dell'animale sia mantenuta tra 37-41 °C (98,6-105 °F)^32,33.
    NOTA: se la sonda ha dimensioni errate, l'animale può posare sopra la sonda di temperatura.
12. Fissare la testa dell'animale in posizione o appoggiare il becco contro un oggetto per evitare movimenti indesiderati. Questo può essere fatto con l'argilla modellante se la respirazione non è ostruita.
13. Somministrare un'iniezione supplementare di cocktail anestetico che è la metà del dosaggio originale se l'animale inizia a riprendere conoscenza durante il test.
    NOTA: Qualsiasi movimento del corpo o vocalizzazione è un segno che deve essere somministrato un dosaggio di supplemento. I minuscoli movimenti del becco indicano la respirazione e sono accettabili.

4. Posizionamento dell'elettrodo

1. Utilizzare tre elettrodi ad ago in acciaio inossidabile con cloruro d'argento con le seguenti designazioni: l'elettrodo di riferimento, l'elettrodo attivo e l'elettrodo di terra comune.
   NOTA: l'elettrodo di riferimento è anche indicato come invertente o "-". L'elettrodo attivo è anche indicato come non invertente o "+".
2. Posizionare ogni elettrodo sub-dermally 2-3 mm nella testa, ma non abbastanza profondo da penetrare nel cranio. Utilizzare elettrodi di lunghezza e 0,4 mm di diametro.
3. Estrarre l'elettrodo dalla pelle, esponendo la punta. Questo aiuta a ridurre al minimo il contatto con la pelle e garantire una profondità di inserimento costante tra gli animali³⁴.
   NOTA: il filo dell'elettrodo dovrebbe avere un allentamento sufficiente in modo tale che dopo aver posizionato l'elettrodo, non vi sia alcuna tensione che lo estrarrà o tirerà la pelle tesa.
4. Per la registrazione a canale singolo, posizionare l'elettrodo attivo sopra il cranio sulla linea mediana, fino al condotto uditivo.
   1. Posizionare l'elettrodo di riferimento dietro l'orecchio dove verrà erogato lo stimolo e posizionare l'elettrodo di terra dietro il condotto uditivo controlaterale nel collo.
      NOTA: Se si esegue un intervento chirurgico al cranio o al condotto uditivo dell'animale, posizionare l'elettrodo di riferimento nel collo sulla linea mediana dell'animale. Sia questo che il passaggio 4.4.1 sono considerati montaggi di registrazione di elettrodi orizzontali.
5. Per la registrazione a due canali, utilizzare due elettrodi negativi e un elettrodo positivo combinato che richiede un cavo adattatore. Posizionare l'elettrodo di terra per via subdermica nel collo e un elettrodo di riferimento dietro ciascun condotto uditivo.
6. Controllare l'impedenza dell'elettrodo. Assicurarsi che l'impedenza complessiva dell'elettrodo non superi i 5,0 kΩ. Mantenere l'impedenza interelettrode al di sotto di 3,0 kΩ.

5. Registrazione ABR

1. A seconda dell'hardware e del software di acquisizione, assicurarsi di eseguire la calibrazione per i livelli sonori corretti tra le frequenze di stimolo utilizzate.
   NOTA: le tecniche di calibrazione variano in base all'attrezzatura (vedere la discussione). Per alcuni programmi, l'attenuazione del suono può essere modificata all'interno del software. Le procedure di calibrazione eseguite qui prevedevano l'utilizzo di un microfono a condensatore B&K 4138 da 1/8 di pollice per registrare gli stimoli di frequenza all'interno di un sistema di accoppiamento chiuso che si avvicinava al condotto uditivo del pulcino (~ 5 mm). Una tabella di calibrazione della schiusa del pollo è fornita come tabella supplementare.
2. Spostare l'apparato del trasduttore del suono verso l'orecchio attivo dell'animale. Posizionare il trasduttore sonoro a una profondità ridotta di 2 mm nel condotto uditivo.
   NOTA: A seconda del trasduttore sonoro, uno speculum di plastica può essere fissato e inserito nel condotto uditivo. Il posizionamento dello speculum è fondamentale. Se il suono è bloccato dalla parete del canale o il condotto uditivo è pizzicato chiuso, gli ABR saranno assenti o assomiglieranno a uno spostamento di ~ 40 dB nella soglia.
3. Controllare l'animale durante il test se i risultati sembrano anormali o assenti. Se lo sono, riposizionare il trasduttore sonoro nel condotto uditivo.
   NOTA: poiché la pelle è sciolta ed è possibile il movimento degli animali, il posizionamento dello speculum può cambiare durante la registrazione. Tuttavia, con una corretta iniezione anestetica e l'animale completamente incosciente, la registrazione può andare ininterrotta per 30-45 minuti.

6. Acquisizione dati

1. Utilizzare attrezzature / software sufficienti per generare stimoli sonori e registrare / acquisire registrazioni ABR.
   NOTA: esistono molti sistemi disponibili in commercio o personalizzati per l'acquisizione ABR. Per questi esperimenti, è stata utilizzata la piattaforma USB SmartEP Intelligent Hearing Systems (IHS) disponibile in commercio. La capacità di manipolare i parametri di registrazione è fondamentale; questi includono, ma non sono limitati a intensità di stimolo, lunghezza dello stimolo, frequenza dello stimolo, tasso di presentazione dello stimolo, filtro passa alto e passa basso, rifiuto dell'artefatto, numero di sweep, frequenza di campionamento, forma dell'inviluppo e polarizzazione dello stimolo.
2. Impostare i limiti superiore e inferiore di espulsione dell'artefatto (AR) su ±25 μV, in modo che il movimento o il rumore degli animali durante una scansione escludano tale sweep dall'analisi. In tutta la popolazione testata, meno dell'1% delle scansioni totali è stato respinto a causa di artefatti.
3. Raccogli almeno 1024 sweep per ottenere una risposta media grande. Questo può essere fatto in due registrazioni di 512 sweep ciascuna. Ciò garantisce anche che la risposta sia evocata dallo stimolo e ripetibile.
4. Impostare il guadagno su 100.000, il filtro passa-basso su 100 Hz e il filtro passa-alto su 3000 Hz.
   NOTA: le impostazioni del filtro passa-basso e alto erano ottimali per le registrazioni con il sistema IHS. Pertanto, questi parametri sono raccomandazioni. Le registrazioni ABR in altre specie aviarie utilizzando il software BIOSIG filtravano il segnale tra 30 e 3000 Hz 5,13,14,16,22.
5. Imposta il tasso di presentazione dello stimolo tra 10 e 20 stimoli al secondo. Le elevate velocità di presentazione sposteranno la latenza di picco ABR, in particolare per i picchi successivi¹³. Bassi tassi di presentazione aumenteranno il tempo necessario per acquisire l'ABR.
6. Impostare la durata dello stimolo del clic su 100 μs.
   1. Se si utilizza uno stimolo di scoppio di tono, modificare la frequenza e la durata dello stimolo in base all'effetto desiderato. Un intervallo di 100-4000 Hz è stato utilizzato per gli stimoli di scoppio del tono, sebbene la gamma di udito comportamentale nei polli adulti varia da 2-9000 Hz³⁵.
      NOTA: nel sistema IHS, il tempo di salita e discesa di uno stimolo di scoppio del tono può essere modificato solo se la forma dell'involucro spettrale è un trapezio. Tuttavia, il coseno quadrato e le buste blackman forniscono un tempo di salita e discesa preimpostato che viene comunemente usato negli esperimenti ABR sugli animali. Il sistema IHS può visualizzare l'involucro spettrale di una raffica di toni per garantire tempi di salita e discesa appropriati. Il tempo di salita e discesa di uno stimolo di clic non può essere modificato in IHS.
7. Impostare la frequenza di campionamento sul valore più alto consentito (di solito 40 kHz) per i dati con la migliore risoluzione.
   NOTA: alcuni sistemi, incluso IHS, utilizzano un numero limitato di punti di campionamento e modificano la lunghezza della finestra di registrazione. Una frequenza di campionamento di 40 kHz (periodo di 25 μs) può consentire solo una finestra di registrazione di 12 ms, quindi per catturare un ABR a raffica di tono, è stata utilizzata una frequenza di campionamento di 20 kHz (periodo di 50 μs) per consentire una finestra di registrazione di 24 ms. Se si confrontano direttamente gli ABR di scatto e di tono, mantenere costante la frequenza di campionamento per mantenere la stessa risoluzione.
8. Impostare la polarizzazione dello stimolo su alternanza. Questo viene fatto per eliminare la visualizzazione della microfonia cocleare dalle registrazioni ABR. Per visualizzare la microfonia cocleare, utilizzare la rarefazione o la condensazione per la polarità dello stimolo.
   NOTA: molte impostazioni possono essere modificate quando si selezionano gli stimoli. Le impostazioni di guadagno e filtro fornite potrebbero non essere ottimali per altre configurazioni dell'apparecchiatura. Le impostazioni predefinite di fabbrica sulla maggior parte delle macchine ABR non sono impostate per la registrazione nel pollo da cova.
9. Se si registrano 512 sweep, combinare due test separati per creare una media di sweep di 1024.
10. Per uno stimolo a scatto o tono, acquisire un ABR con un'intensità sopra soglia.
11. Continuare a registrare a intensità sempre più basse fino a quando la risposta evocata non può più essere identificata.
12. Definisci la soglia ABR come l'intensità di stimolo più bassa che suscita una risposta evocata rilevabile. Abbassare l'intensità dello stimolo con passi di 5 dBSPL per trovare l'intensità di stimolo più bassa che suscita un picco rilevabile.

7. Eutanasia e fine dell'esperimento

1. Una volta acquisiti gli ABR, preparare un sovradosaggio (0,1 mL) di soluzione di eutanasia (Pentobarbital Sodium 390 mg/mL Phenytoin Sodium 50 mg/mL).
2. Dopo aver usato un pizzico della punta per confermare che non c'è riflesso, iniettare la soluzione di eutanasia nel muscolo mammario con un ago da 29 G a una profondità di 5 mm. La tecnica di iniezione è la stessa dell'iniezione anestetica.
   NOTA: L'animale scadrà dopo pochi minuti. Non manipolare o decapitare l'animale fino a quando non viene rilevato alcun movimento. Una tecnica alternativa di eutanasia consiste nell'eseguire un'iniezione endovenosa nella vena brachiale sotto l'ala.
3. Non appena l'animale non è riflessivo e la respirazione e il battito cardiaco sono cessati, decapitare rapidamente con forbici affilate o cesoie.
4. Pulire la piastra riscaldante, la sonda rettale e gli elettrodi di cloruro d'argento con salviette alcool isopropilico al 70%.
5. Assicurati che tutte le tracce acquisite siano state salvate. Per ulteriori analisi, esportare i file come file .txt che possono essere visualizzati nel blocco note o importati in un foglio di calcolo.

Risultati

Registrazioni ABR rappresentative per pulcini da cova
I seguenti risultati rappresentativi e di popolazione provengono da registrazioni ABR effettuate in 43 animali. In risposta a uno stimolo di clic sopra soglia (75 dBSPL), sono stati costantemente osservati tre picchi positivi in tutti i piccoli. Questi picchi si sono verificati entro 6 ms dopo l'inizio dello stimolo. Raramente, un quarto picco è stato osservato anche a ~ 6 ms. Mentre l'identificazione dei picchi ABR negli uccelli variava tra gli animali (vedi discussione), i picchi sono stati etichettati e identificati come onde numeriche romane I-IV. Una forma d'onda ABR rappresentativa con picchi marcati è mostrata nella Figura 1A (traccia superiore). La Figura 1B mostra la funzione latenza-intensità per le onde I e III etichettate nella traccia rappresentativa. La latenza di picco dell'onda I è aumentata di ~ 0,3 ms per ogni diminuzione di 20 dB dell'intensità dello stimolo. In media, le onde I-III si sono verificate rispettivamente a 1,50 ms (±0,02 ms), 3,00 ms (±0,06 ms) e 4,13 ms (±0,09 ms) a 75 dBSPL (Figura 1C). L'onda I e l'onda III sono sempre presentate come un picco singolare. Occasionalmente per l'onda II, sono stati osservati più piccoli picchi tra 2,5-3,2 ms. Ogni picco aveva una depressione corrispondente, e l'ampiezza da picco a valle dell'onda I - la più grande di tutte le vette - era in media di 7 μV e si avvicinava a un'ampiezza massima di 11 μV a 75 dB SPL.

Oltre alla più grande ampiezza, l'onda I del pulcino ABR presentava la minima variabilità nella latenza di picco tra gli animali. Pertanto, questo picco è stato utilizzato per stimare la sensibilità della soglia uditiva. Le soglie ABR sono state definite come l'intensità di stimolo più bassa che ha suscitato un picco di forma d'onda identificabile e ripetibile. Questo è stato determinato soggettivamente dallo sperimentatore e incrociato da un secondo sperimentatore per l'accordo di soglia. I picchi erano meglio definiti e più facili da identificare quando si utilizzavano stimoli di clic, ma le esplosioni di tono generavano anche picchi definiti e identificabili che variavano a seconda della frequenza dello stimolo e dei suoi parametri (Figura 1D, n = 4 pulcini). La soglia ABR evocata dal clic era inferiore alla soglia evocata dal tono burst, ad eccezione di 1000 Hz. Le soglie variavano tra 10-30 dBSPL per gli stimoli di clic. Gli ABR evocati a clic che non mostravano picchi identificabili >30 dBSPL erano spesso il risultato dello speculum che veniva spostato dal condotto uditivo a causa del movimento degli animali.

La diminuzione della temperatura corporea aumenta le latenze ABR
La velocità dell'attività neurale - misurata dal picco di presenza di un'ampiezza della forma d'onda (cioè latenza) - è nota per diminuire a temperature corporee più basse^36,37. Questo fenomeno è stato osservato negli ABR di pollo da cova utilizzando uno stimolo di clic di 75 dBSPL. Una traccia rappresentativa è mostrata nella Figura 2A. Poiché la temperatura corporea è diminuita da 39 ° C, la latenza dei picchi ABR si è verificata più tardi nel tempo, nonostante lo stesso livello di intensità dello stimolo. La figura 2B mostra la latenza delle onde I e III in funzione delle temperature corporee più basse per la traccia rappresentativa. C'era una forte correlazione (R² = 0,89) tra le temperature corporee più basse e il verificarsi della latenza di picco dell'onda I (Figura 2C, n = 5 pulcini). Questi risultati dimostrano la necessità di mantenere una temperatura corporea quasi normale durante le registrazioni ABR. Se la temperatura corporea quasi normale non viene mantenuta, le funzioni di latenza-intensità e le misurazioni di ampiezza dell'ABR sono altamente variabili e spesso imprecise.

Differenze di latenza e ampiezza nei primi piccoli
La ricerca ha dimostrato che l'attività neurale correlata all'insorgenza dell'udito per il pulcino è vicina alla maturazione all'età embrionale tardiva di^{8 anni}. Tuttavia, per un sottogruppo di piccoli molto precoci (<3 h post-hatch), abbiamo osservato uno spostamento di latenza di picco delle forme d'onda ABR (n = 4) in risposta a uno stimolo di clic SPL di 75 dB o potenziali evocati non identificabili (n = 2 pulcini). In 2 giovani cuccioli, non è stato possibile suscitare ABR a raffica di tono e le soglie di clic sono state elevate di 50 dBSPL. Ciò potrebbe essere dovuto a un problema conduttivo in cui c'è ancora fluido nel condotto uditivo / cavità dell'orecchio medio dell'animale o una componente neurale sottosviluppata. Studi sui mammiferi hanno riportato spostamenti di soglia di 50 dB nei neonati^38,39. Gli animali rappresentativi usati qui avevano >3 ore, che coincidevano anche con il tempo necessario per asciugare le piume. La Figura 3A mostra gli ABR registrati da piccoli giovani (P1, <3 h) e anziani (P2). Per l'analisi, solo 3 giovani piccoli hanno presentato tutti e tre i picchi ABR. Le latenze della forma d'onda di picco sono state significativamente prolungate e le ampiezze della forma d'onda sono state leggermente ridotte rispetto ai piccoli più vecchi (Figura 3B-C, rispettivamente).

Posizionamento dell'elettrodo di riferimento e registrazioni ABR a due canali
Nella Figura 4, il posizionamento dell'elettrodo di riferimento è stato modificato tra 2 posizioni diverse, ma ha comunque portato a registrazioni ABR comparabili. Un confronto tra 75 tracce di clic dBSPL nello stesso animale con i due posizionamenti degli elettrodi di riferimento ha mostrato differenze minime nelle ampiezze della forma d'onda da picco a valle e nelle latenze della forma d'onda di picco (Figura 4A). Il posizionamento del mastoide era metodologicamente simile agli esperimenti ABR dei mammiferi che posizionano l'elettrodo di riferimento sul mastoide o sulla pinna. L'uso di un posizionamento del collo per l'elettrodo di riferimento sarebbe utile se la manipolazione o la chirurgia fosse eseguita su entrambi gli auricolari. È interessante notare che l'ampiezza del picco dell'onda II per il posizionamento mastoideo (traccia rossa) si è verificata 1 ms dopo il picco dell'onda II per il posizionamento del collo (traccia nera). Questa differenza di tempo probabilmente riflette i siti della generazione neurale ABR rispetto al posizionamento dell'elettrodo.

Utilizzando una configurazione a due canali, un elettrodo di registrazione attivo (posizionamento superiore della testa) e due elettrodi di riferimento (posizionamenti mastoidi) sono stati utilizzati per ottenere ABR sia per le orecchie sinistra che destra (Figura 4B). Le risposte tra le due orecchie erano simili, con piccoli cambiamenti nelle ampiezze di picco probabilmente dovuti al posizionamento degli auricolari. La latenza dell'orecchio sinistro e destro equivalente ha supportato la funzione altrettanto sana di entrambe le orecchie e degli emisferi del tronco cerebrale nel pollo da cova. Il montaggio di registrazione a due canali potrebbe essere utilizzato anche per gli ABR binaurali, ma ci sarebbero ulteriori considerazioni necessarie per tali registrazioni.

Figura 1: Registrazioni rappresentative di pulcini da cova a stimoli evocati da clic e tono. (A) Registrazioni ABR rappresentative da un pulcino da cova (P2) in funzione di diversi livelli di intensità dello stimolo. Tre o quattro picchi positivi nei microvolt (μV) possono essere identificati entro 6 ms dopo l'insorgenza dello stimolo (tempo = 0 ms). Le onde sono state identificate usando numeri romani. Le ampiezze da picco a minimo diminuiscono a livelli di intensità di stimolo più bassi. (B) Funzioni di latenza-intensità delle onde I e III per la traccia rappresentativa mostrata al punto (A). Solo questi picchi sono stati analizzati, poiché l'onda II non è stata tipicamente osservata a intensità <45 dBSPL. (C) Latenza delle forme d'onda di picco ABR evocate dal clic (n = 43 pulcini). Le barre di errore indicano l'errore standard della media (SEM). (D) ABR (tracce nere) mediate evocate dal tono per quattro pulcini piccoli a tre frequenze diverse. Tracce rosse = errore standard degli stimoli medi (SEM) = 75 dBSPL. In questa e nelle figure successive, le barre di errore denotano SEM e l'orecchio destro era l'orecchio di stimolo. (eccezione per la Figura 4B in cui entrambe le orecchie sono state stimolate). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Effetto della temperatura corporea sulle registrazioni ABR. (A) Registrazioni ABR rappresentative di un pulcino da cova (P2) in funzione della temperatura corporea. Per le temperature corporee più basse, le latenze della forma d'onda di picco sono aumentate mentre le ampiezze da picco a valle sono rimaste relativamente invariate. (B) Funzione latenza-temperatura delle onde I e III per le tracce rappresentative di cui alla lettera A). (C) Dati sulla popolazione che mostrano la relazione tra latenza e variazioni di temperatura per 5 pulcini (p < 0,01, R² = 0,89). Una tendenza simile è stata osservata per le onde II e III (dati non mostrati). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Differenze legate all'età nelle registrazioni ABR. (A) Registrazioni ABR rappresentative (sovrapposte) di un pulcino da cova rappresentativo a P2 (traccia nera) e P1 (<3 ore post-schiusa, traccia rossa). (B) Latenze della forma d'onda di picco per le onde I, II e III in funzione dell'età. Le latenze per waves I-III erano significativamente diverse tra le età (P < 0,05, n = 6 pulcini). (C) Ampiezze della forma d'onda da picco a valle delle onde I, II e III in funzione dell'età. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Posizionamento dell'elettrodo e registrazioni ABR a due canali: (A) Registrazioni ABR rappresentative (sovrapposte) dello stesso pulcino da cova (P2) con l'elettrodo di riferimento posto nel collo (traccia nera) o mastoide (traccia rossa). L'elettrodo attivo è stato posizionato sulla linea mediana del cranio per entrambi i montaggi di registrazione dell'elettrodo. La latenza delle onde I e III e l'ampiezza delle onde I e III sono quasi identiche in entrambe le condizioni. La latenza dell'onda II è precedente e l'ampiezza è maggiore per l'elettrodo posto nel tessuto del collo. (B) Registrazione a due canali mentre stimola in sequenza le orecchie destra e sinistra. Registrazioni ABR rappresentative (sovrapposte) dello stesso pulcino da cova (P2) con gli elettrodi di riferimento posti nel mastoide dell'orecchio sinistro (tracce blu) e dell'orecchio destro (tracce rosse) a tre diversi livelli di intensità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare: Tabella di calibrazione della schiusa del pollo. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Il tronco cerebrale uditivo degli uccelli è ben studiato e molte strutture sono analoghe alla via uditiva dei mammiferi. Il nervo uditivo fornisce input eccitatori sui due nuclei centrali del primo ordine, il nucleo cocleare magnocellularis (NM) e angularis (NA). La NM invia una proiezione eccitatoria bilateralmente al suo bersaglio uditivo, il nucleo laminare (NL)⁷. NL progetti al nucleo mesencefalico laterale, pars dorsalis (MLd)^40,41. NL proietta anche al nucleo olivario superiore (SON), che fornisce inibizione del feedback a NM, NA e NL⁴². Questo microcircuito del tronco cerebrale uditivo inferiore è squisitamente conservato per la funzione che assolve, la localizzazione del suono e l'udito binaurale³³. Le regioni superiori del tronco cerebrale uditivo dell'uccello hanno anche nuclei analoghi al lemniscus laterale dei mammiferi e al collicolo inferiore nel mesencefalo. Date queste somiglianze, la composizione dell'ABR aviario fino al mesencefalo uditivo è paragonabile a tutti i vertebrati.

Mentre più specie aviarie mostrano tre picchi positivi entro 6 ms dopo l'insorgenza dello stimolo, la correlazione dei picchi ABR con le strutture uditive centrali ha una certa variabilità. Si può ragionevolmente presumere che l'onda I sia la prima risposta neurale dalla papilla basilare periferica e dal nervo uditivo e mostra poca variabilità tra gli individui (Figura 1C). La successiva identificazione dell'onda è meno certa e può differire tra le specie. Kuokkanen et ^al.17 hanno recentemente determinato che l'onda III dell'ABR del barbagianni è generata da NL; pertanto, è ragionevole sostenere che l'onda II provenga da NM e NA del nucleo cocleare²⁰. Tuttavia, il gufo Wave III è stato definito come il picco positivo generato 3 ms dopo l'inizio dello stimolo. Questo corrisponde all'onda II come definita nel pollo da cova ABR. Nel barbagianni ABR, le onde I e II sono state combinate.

Mentre il pollo da cova di solito presentava tre picchi entro 6 ms, occasionalmente è stato osservato un quarto picco (ad esempio, vedi Figura 1A). I dati sulla popolazione, le dimensioni del campione più grandi e ulteriori paradigmi sperimentali sarebbero necessari per supportare una quarta ondata e, in alcuni casi, un ABR di pollo a cinque onde. La scoperta più coerente sono state le tre rappresentazioni dei picchi mostrate qui.

Poiché l'ABR è definito come una misura della sincronia neurale, i nuclei principali nel percorso uditivo potrebbero rappresentare ogni picco positivo nell'ABR. Il segnale che passa dal nervo uditivo a NM/NA e poi a NL può definire rispettivamente le onde I, II e III nel pollo da cova ABR. Inoltre, il quarto picco successivo dell'ABR di pollo potrebbe rappresentare un tronco cerebrale superiore o una struttura uditiva del mesencefalo. La caratterizzazione degli ABR aviari dovrebbe anche considerare la differenza tra uccelli precoci e altriciali. La maturazione delle risposte uditive varierà tra le specie ed è influenzata anche da altri tratti critici come il comportamento dei predatori e / o l'apprendimento vocale⁴. Indipendentemente da ciò, i metodi e le tecniche descritte sono facilmente applicabili a una varietà di specie aviarie e vertebrate.

L'importanza di mantenere la temperatura corporea animale è illustrata nella Figura 2. Man mano che la temperatura corporea interna diminuiva, la latenza delle risposte ABR aumentava per lo stesso livello di intensità dello stimolo. Questo è più pronunciato quando la temperatura corporea scende al di sotto di 32 °C^36,37. L'aumento della latenza di circa 1 ms nell'ABR è inferiore a quello precedentemente riportato nel pollo²³. Tuttavia, Katayama²³ ha utilizzato un cucciolo di 12 giorni che è stato raffreddato e successivamente riscaldato per un periodo di 4 ore. I dati nella Figura 2 sono stati registrati durante il processo di raffreddamento per un periodo di 20 minuti. Per acquisire la migliore qualità e le registrazioni più coerenti, la temperatura corporea dell'animale deve essere mantenuta e tutte le registrazioni devono essere eseguite alla stessa temperatura fisiologica tra gli animali.

L'effetto dell'età sull'ABR è lieve ma importante da considerare. Mentre solo la latenza delle onde I e II dell'ABR era significativamente diversa, ciò è in parte dovuto al fatto che solo tre giovani cuccioli sono stati utilizzati nella Figura 3; gli altri tre non si presentavano con tre picchi ABR identificabili. L'ampiezza ABR e gli spostamenti di soglia possono anche essere evidenti se si utilizzano campioni di grandi dimensioni o si confrontano ABR specifici per frequenza. Questo effetto legato all'età potrebbe essere causato dal fluido nell'orecchio medio del pollo. Tali cambiamenti conduttivi portano ad un marcato aumento delle soglie ABR sia per i modelli umani che per altri modelli di mammiferi^38,39.

Utilizzando due diversi montaggi di registrazione, sono state osservate risposte simili (Figura 4A). Mentre il montaggio più comune posiziona l'elettrodo di riferimento dietro l'orecchio che riceve lo stimolo, avere l'elettrodo di riferimento nel tessuto del collo può essere utile se c'è un intervento chirurgico che accompagna l'ABR. Tuttavia, se si utilizzano registrazioni ABR a due canali, gli elettrodi di riferimento devono essere posizionati separatamente e simmetricamente, il che è difficile se si posiziona l'elettrodo di riferimento nel collo. Si consiglia la posizione mastoidea per l'elettrodo di riferimento per standardizzare il maggior numero possibile di aspetti della registrazione. La registrazione ABR a due canali è uno strumento efficace che richiede poca preparazione extra e si traduce in risposte simili tra le orecchie. Piccole differenze di ampiezza erano probabilmente dovute al posizionamento dell'auricolare. La registrazione a due canali consente un facile confronto tra un orecchio o un emisfero cerebrale manipolato sperimentalmente rispetto a un controllo. Questa configurazione sarebbe necessaria anche per testare gli ABR binaurali. Esperimenti futuri con l'ABR di pollo possono fare riferimento alla letteratura precedente sulle configurazioni di registrazione e sui montaggi³⁴.

Questa metodologia presenta diverse limitazioni. Come accennato nel passaggio 5.1, un cattivo posizionamento dello speculum può portare a uno spostamento di 40 dBSPL in risposta. Ciò potrebbe causare un'interpretazione errata di un animale manipolato o modificato. Si raccomandano le seguenti precauzioni: acquisire un ampio campione di dati di controllo prima di acquisire gli ABR di modelli manipolati o mutanti. Non diminuire l'intensità dello stimolo di oltre 20 dBSPL tra le registrazioni. Se l'ampiezza o la latenza si sposta più del previsto, controllare la posizione dell'animale e dello speculum. Ripeti quello stimolo ABR per osservare i cambiamenti. Se lo speculum si è spostato, riacquistare i test precedenti. Un'altra limitazione è la calibrazione degli ABR. Senza un'adeguata calibrazione per registrare il livello di pressione sonora, l'intensità presentata all'animale è sconosciuta. Quando si misura l'uscita sonora, utilizzare lo stesso speculum della registrazione sperimentale e un piccolo microfono all'interno di una cavità che si avvicina alla lunghezza del condotto uditivo dell'animale (~ 5 mm). Misurare le stesse frequenze di tono utilizzate negli esperimenti, poiché le calibrazioni sono specifiche della frequenza. Il manuale per i sistemi hardware e software può venire con le istruzioni per la calibrazione. Ci sono anche filtri aggiuntivi come i filtri di fase lineare e di fase minima, che possono migliorare il clic e il tono burst ABR⁴³. Questi filtri non sono stati utilizzati nel presente studio. Non sono state esaminate nemmeno considerazioni aggiuntive, come il tempo di salita e discesa di un inviluppo spettrale di scoppio di tono che cambia in funzione della frequenza o che cambia il tempo di salita e discesa degli stimoli di clic. Queste sono buone indagini future una volta che è possibile acquisire ACR affidabili e coerenti.

Il confronto del pollo da cova con altri modelli aviari è promettente. Anche i pappagallini e i gufi striduli orientali mostrano tre picchi di microvolt positivi entro i primi 6 ms dell'ABR^13,22. In diverse specie di picchi, si vedono anche tre picchi, ma la loro latenza è più tardi nel tempo. Inoltre, la gamma della migliore sensibilità di frequenza nei picchi è compresa tra 1500 e 4000 Hz, che è leggermente superiore alla migliore soglia del pollo a 1000 Hz. Nel pollo adulto, la migliore sensibilità è a 2000 Hz³⁵, quindi potrebbe esserci un miglioramento dell'udito delle alte frequenze man mano che i piccoli di pollo si sviluppano in adulti. Tale sviluppo differirà tra le specie di uccelli, tenendo conto dello sviluppo altriciale o precoce dell'animale⁴.

I metodi sperimentali qui descritti possono aiutare a determinare quali fattori portano a danni o cambiamenti nelle risposte uditive e nelle soglie, nonché studi in diverse fasi dello sviluppo embrionale. La manipolazione genetica, l'invecchiamento e l'esposizione al rumore sono tutte manipolazioni note negli animali e in altri modelli aviari ^24,25,44,45. Questi metodi dovrebbero essere estesi al modello del pollo ora che tecniche come l'elettroporazione in-ovo consentono l'espressione di proteine che sono controllate focalmente e temporalmente su un lato del tronco^{cerebrale uditivo 12,46}. Ciò consente il confronto diretto degli ABR dall'orecchio geneticamente manipolato all'orecchio di controllo controlaterale utilizzando un paradigma di registrazione a due canali.

Nel complesso, l'ABR dei polli da cova è un metodo di ricerca utile, quasi identico alle misure della funzione uditiva in modelli umani e altri mammiferi. È anche una metodologia non invasiva e in vivo . A parte l'iniezione anestetica e il posizionamento di elettrodi subdermici di pochi millimetri, non è richiesta nessun'altra manipolazione fisica. Un cucciolo potrebbe teoricamente essere testato più volte nel corso di un periodo di sviluppo di giorni o settimane se tenuto in un ambiente appropriato. Questo protocollo non solo stabilisce i passaggi necessari e i parametri di registrazione per il pollo da cova ABR, ma propone le caratteristiche di un ABR aviario che possono informare ulteriori test sulla funzione uditiva del tronco cerebrale.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/8 inch B&K Microphone	Brüel & Kjær	4138	Type 4138-A-015 also works
Auditory Evoked Potential Universal Smart Box	Intelligent Hearing Systems	M011110
Custom Sound Isolation Chamber	GK Soundbooth Inc	N/A	Custom built
DC Power Supply	CSI/Speco	PSV-5
ER3 Insert Earphone	Intelligent Hearing Systems	M015302	Used as sound transducer
Euthasol	Virbac	710101	Controlled Substance; euthanasia solution
Insulin Syringe (29 G)	Comfort Point	26028
Ketamine	Covetrus	11695-0703-1	Controlled Substance
Power Supply	Powervar	93051-55R
Rectal Probe	YSI	401 (10-09010)	Any 400 series probe will work with the YSI temperatuer monitor
Subdermal needles	Rhythmlink	RLSND107-1.5
Temperature Monitor	YSI	73ATA 7651	Works with any 400 series rectal probe
Xylazine	Anased	59399-110-20	Used with ketamine and water for anesthetic