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Il presente protocollo mostra come differenziare le cellule CD3−/CD45+CD56+ con citotossicità lieve dalle cellule staminali umane a potenziale espanso (hEPSC) sia in condizioni di coltura 3D che 2D. Ciò consente la convalida fenotipica di routine senza la distruzione del complesso microambiente.
La differenziazione delle cellule natural killer (NK) dalle cellule staminali pluripotenti umane consente la ricerca e la produzione di prodotti cellulari di grado clinico per l'immunoterapia. Qui è descritto un protocollo a due fasi che utilizza un mezzo commerciale privo di siero e un cocktail di citochine (interleuchina [IL]-3, IL-7, IL-15, fattore delle cellule staminali [SCF] e ligando tirosin-chinasi 3 FMS-like [Ftl3L]) per differenziare le cellule staminali umane a potenziale espanso (hEPSC) in cellule che possiedono proprietà delle cellule NK in vitro con tecnologia di coltura sia tridimensionale (3D) che bidimensionale (2D). Seguendo questo protocollo, le cellule NK CD3-CD56+ o CD45+CD56+ vengono generate in modo coerente. Quando cocolti con bersagli tumorali per 3 ore, i prodotti differenziati mostrano una lieve citotossicità rispetto a una linea cellulare permanente IL-2-indipendente, cellule NK92mi. Il protocollo preserva la complessità del microambiente di differenziazione mediante la generazione di strutture 3D, facilitando così lo studio delle relazioni spaziali tra le cellule immunitarie e le loro nicchie. Nel frattempo, il sistema di coltura 2D consente la convalida fenotipica di routine della differenziazione cellulare senza danneggiare la delicata nicchia di differenziazione.
Rispetto alle cellule staminali pluripotenti convenzionali come le cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC), le cellule staminali umane a potenziale espanso (hEPSC) sono più vicine allo stato di totipotenza, in quanto possono differenziarsi in linee sia extraembrionali che embrionali1. Ad esempio, gli hEPSC possono essere differenziati in trofoblasti1 e cellule simili a sacchi vitellini2. Per ottenere la potenza unica degli hEPSC, un singolo blastomero viene coltivato in un terreno contenente diverse piccole molecole che inibiscono l'impegno di lignaggio segnalando1, che viene indicato come mezzo EPSC (EPSCM). La coltura di hESC e hiPSCs nell'EPSCM espande la loro potenza precedentemente limitata per differenziarli in cellule trofoblaste1.
Le cellule staminali pluripotenti sono un prezioso strumento di ricerca per sperimentare nuove modificazioni genetiche. A causa delle capacità di auto-rinnovamento e differenziazione delle cellule staminali pluripotenti, un clone trasformato di una cellula staminale pluripotente può produrre prodotti cellulari differenziati che possiedono la stessa modificazione genetica nello stesso luogo. Zhu e Kaufman hanno stabilito lo standard per la differenziazione delle cellule NK dalle cellule staminali pluripotenti convenzionali (hESCs e hiPSCs)3. In primo luogo, hanno indotto cellule staminali ematopoietiche (HSC) da un corpo embrioide derivato da cellule staminali pluripotenti. L'aggiunta del fattore delle cellule staminali (SCF), del ligando tirosin-chinas-simile 3 (Ftl3L), dell'interleuchina (IL)-7, IL-15 e di un primo supplemento di IL-3 ha influenzato le HSC per svilupparsi in cellule natural killer (NK). Successivamente, hanno ampliato le cellule NK con cellule presentanti l'antigene artificiale (aAPC), che presentano IL-21 legata alla membrana, con la continua integrazione di IL-2. I ricercatori hanno applicato questo approccio all'immunoterapia al fine di generare cellule natural killer derivate da iPSC dotate del recettore dell'antigene chimerico (CAR-iNK)4.
Le cellule NK umane sono definite come leucociti CD3-CD56+ nel sangue periferico. Sono effettori contro le cellule infette da virus e le cellule tumorali5. Alcuni recettori inibitori sulle cellule NK riconoscono molecole espresse ubiquitariamente nelle cellule normali. Ad esempio, l'eterodimero NKG2A/CD94 espresso sulle cellule NK riconosce le molecole MHC di classe I5. Nel frattempo, i recettori attivanti sulle cellule NK riconoscono i ligandi indotti dallo stress, come il modo in cui NKG2D riconosce la sequenza A correlata al polipeptide MHC di classe I indotta dalla trasformazione (mica / micb)6. Alcune cellule trasformate sottoregolano i loro "auto-ligandi" per sfuggire alla sorveglianza immunitaria e sovraregolare i ligandi aberranti, il che innesca le cellule NK per eseguire il loro macchinario litico. Le capacità antitumorali intrinseche delle cellule NK hanno portato l'attenzione su questo tipo di cellule immunitarie.
La capacità di dare origine simultaneamente a linee sia embrionali che extraembrionali può rendere le hEPSC una ricapitolazione più fedele della nicchia di sviluppo embrionale rispetto alle cellule staminali pluripotenti convenzionali. Per esperienza, è più facile mantenere la potenza delle hEPSC rispetto alle hiPSC. Nel presente studio, è stato sviluppato un protocollo (Figura 1) per polarizzare gli hEPSC a svilupparsi in linee ematopoietiche e successivamente differenziare le cellule progenitrici in cellule natural killer (NK) in vitro. Nel protocollo, i mezzi commerciali sono impiegati per evitare incongruenze sieriche, seguiti dall'aggiunta graduale di citochine alla differenziazione dei pregiudizi nelle linee linfoidi. Questo protocollo ha due sistemi per preservare il complesso microambiente 3D mentre deriva cellule CD3-CD56 + / CD45 + CD56 + che fenotipicamente e funzionalmente assomigliano alle cellule NK umane.
Questo protocollo può essere utile nello studio dell'interazione delle cellule immunitarie con le loro nicchie di differenziazione e può avere il potenziale per purificare i prodotti cellulari per usi immunoterapeutici.
Il presente studio ha comportato esperimenti in vitro ; Pertanto, l'approvazione etica non è applicabile. Le linee cellulari stabilite utilizzate in questo studio sono state ottenute da fonti commerciali (vedi la tabella dei materiali).
1. Generazione di strutture organoidi 3D da hEPSC
2. Mesoderma e pattern emato-endoteliale del corpo embrioide (EB)
3. Differenziazione delle cellule NK
4. Raccolta di cellule mature
È stato ipotizzato che gli attuali prodotti di differenziazione in vitro (IVD) possedessero marcatori di superficie e capacità antitumorali simili alle cellule NK umane.
Il marcatore di definizione delle cellule NK umane è stato accessibile per verificare se i prodotti di differenziazione dal sistema di coltura 3D producevano cellule che assomigliavano fenotipicamente alle cellule NK umane. Circa il 15% delle cellule dissociate dal sistema di coltura 3D da due lotti indotti in diversi punti temporali (n = 2) erano CD3-CD56+ (Figura 3A). CD3 è stato sostituito con CD45 (un marcatore pan-leucocitario) nel pannello di prova a causa dell'assenza di CD3 e della difficoltà di indurre cellule T in vitro. Circa il 16% delle cellule dissociate dalla struttura 3D erano CD45 + CD56 + (Figura 3B, n = 1), che è in linea con le percentuali di cellule CD3-CD56+ osservate negli studi precedenti. Le percentuali di cellule CD3-CD56+ nelle cellule raccolte dal sistema di coltura 2D variavano dal 30% al 6%, da induzioni di maggior successo (Figura 3C, n = 3) a induzioni meno riuscite (Figura 3D, n = 2). Sono stati convalidati la funzionalità e i fenotipi delle cellule raccolte dal sistema di coltura 2D. Durante la coltura Day 18 dal sistema 2D, circa il 12% delle cellule ha espresso sia CD56 ectopico che CD107a dopo 2 ore di 50 ng / mL IL-18, 455 UI / mL IL-2 e 20 ng / mL di stimolazione anticorpale anti-CD244 (Figura 4C, n = 1). Circa il 28% delle cellule raccolte erano CD94+CD159a+ (Figura 4B, n = 1). L'espressione ectopica di CD107a, un rivestimento proteico sulla membrana dei granuli, indica la degranulazione10, mentre l'eterodimero CD94/NKG2A (CD159a) è un altro marcatore che definisce le cellule NK. Questo fornisce un esempio della convalida fenotipica e funzionale dei prodotti IVD.
La funzionalità dei prodotti IVD è stata testata dalla loro citotossicità contro le cellule eritroucemiche umane-cellule K562. Il profilo completo del ligando sulle cellule K562 rivela il loro complesso istochimico maggiore sottoregolato I (MHC-I) e l'espressione relativamente forte del ligando NKG2D (come ULBP-1, ULBP-2/5/6 e ULBP-3)11; pertanto, le cellule K562 sono sensibili all'attività litica delle cellule NK12. Entrambi i prodotti endpoint IVD e le cellule NK92mi sono stati innescati con 50 ng / mL IL-18, 455 UI / mL IL-2 e 20 ng / mL anticorpi anti-CD244 durante la notte. Le cellule GFP+ K562 sono state cocoltivate con cellule raccolte da cellule IVD o NK92mi a diversi rapporti effettore-bersaglio (E:T) in presenza di 50 ng/mL (UI non fornita) IL-18, 455 UI/mL IL-2 e 20 ng/mL anticorpi anti-CD244 nello stesso volume di terreno H5100 per 3 ore. La lettura dell'attività di uccisione delle cellule NK è stata l'espressione del marcatore della cellula morta sui sottoinsiemi GFP+. Le celle K562 sono state trasdotte con un vettore di controllo disponibile in commercio (vedi la Tabella dei Materiali) per esprimere costitutivamente la GFP, e l'efficienza della trasduzione è stata di circa l'80% (Figura supplementare 1A). Le percentuali di segnale GFP aggiunto erano proporzionali al numero di cellule GFP+ K562 aggiunte, suggerendo un'espressione specifica di GFP dalle cellule K562 trasdotte (Figura supplementare 1B).
Le percentuali di cellule bersaglio morenti mostrate nella Figura 5 sono state calcolate con la seguente formula13:
Percentuale di cellule morenti = (FITC + DAPI + % di cocoltura [ad esempio, Figura 5A]) - (FITC + DAPI + % di cellule K562 trasdotte)
Di tutti e tre i rapporti E:T valutati (0,1:1, 0,33:1, 1:1), le percentuali di cellule GFP+ morenti erano positivamente correlate con i rapporti E:T quando cocolte con prodotti IVD (Figura 5B, hEPSC-NK) o cellule NK92mi (Figura 5B, NK92mi), indicando l'uccisione specifica dei bersagli tumorali. Tuttavia, la citotossicità dei prodotti IVD era relativamente modesta entro il periodo di tempo testato (Figura 5C).
Infine, la generazione di cellule progenitrici linfoidi è stata confrontata tra le colture 3D e 2D. È stato riscontrato che la condizione di coltura 3D ha generato più cellule progenitrici (55.000 cellule) rispetto alla condizione di coltura 2D (36.000 cellule) (Figura supplementare 2). Ciò suggerisce che il contesto dell'architettura tissutale e dei componenti cellulari nella coltura 3D ha supportato la generazione di cellule progenitrici linfoidi.
Figura 1: Diagramma schematico che mostra la strategia di differenziazione per differenziare le cellule NK dalle hEPSC . (A) Qui viene mostrata la cronologia dei sistemi di coltura 3D, che descrive in dettaglio le condizioni della coltura e brevi parole chiave di ogni fase. L'interfaccia aria-liquido del sistema 3D viene mantenuta durante l'induzione della cella NK. (B) Qui viene mostrata la cronologia dei sistemi di coltura 2D. Le cellule rilasciate raccolte dai giorni 7-10 dalle strutture del sistema 3D vengono seminate su una piastra rivestita senza l'interfaccia aria-liquido. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Morfologia delle cellule osservate in fasi distinte di differenziazione. (A) La morfologia delle hEPSC quando mantenute nell'EPSCM. Gli hEPSC formano colonie a forma di cupola. (B) La morfologia delle hEPSC dopo la pre-differenziazione. Le colonie a forma di cupola sono appiattite. Gli hEPSC vengono raccolti e formano EB con la tecnica della goccia sospesa. Gli EB sono raccolti e coltivati nel mezzo A e poi nel mezzo B. (C) La morfologia di un EB il giorno 10. Durante questo periodo, l'EB inizia ad espandersi e gonfiarsi, formando strutture membranose. (D) La morfologia di un EB che rilascia cellule. Dopo la semina sul transwell, l'EB cresce e rilascia costantemente cellule rotonde nei dintorni. Alcune delle cellule rilasciate vengono raccolte e coltivate su una piastra a 12 pozzetti rivestita con materiali di rivestimento per la differenziazione linfoide. Le popolazioni cellulari sono morfologicamente eterogenee e tendono ad aggregarsi insieme. (E) La morfologia delle cellule osservate all'endpoint dell'IVD. Si osservano piccole cellule di sospensione circolari (freccia nera). Barre della scala: (A,B,E) = 100 μm; (C,D) = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Grafici FACS rappresentativi di prodotti derivati da hEPSC all'endpoint. Le cellule vengono incubate con anticorpi coniugati al fluoroscopio su ghiaccio per 30 minuti. I campioni vengono colorati con DAPI prima di essere caricati nella porta di iniezione del campione FACS. Le cellule non colorate vengono utilizzate per stabilire il gating negativo. (A) Grafico rappresentativo FACS sull'espressione di CD3 e CD56 in cellule dissociate dal sistema di coltura 3D da due lotti (n = 2). (B) Grafico rappresentativo FACS sull'espressione di CD45 e CD56 in cellule dissociate dalla coltura 3D (n = 1). (C) Grafico rappresentativo FACS sull'espressione di CD3 e CD56 in cellule raccolte dalla piastra rivestita da un'induzione riuscita (n = 3). (D) Grafico FACS rappresentativo sull'espressione di CD3 e CD56 dalla piastra rivestita quando l'induzione è subottimale (n = 2). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Grafico rappresentativo FACS su prodotti derivati da hEPSC durante la coltura Day 18 (n = 1). (A) Grafico FACS sull'espressione di CD56 e CD107a dopo 2 ore di stimolazione con anticorpi IL2, IL-18 e anti-CD244. (B) Grafico FACS sull'espressione CD159a e CD94. I campioni vengono colorati con DAPI prima di essere caricati nella porta di iniezione del campione FACS. Le cellule non colorate vengono utilizzate per stabilire il gating negativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Grafico delle percentuali di cellule morenti rispetto a diversi rapporti E:T dalla cocoltura di cellule GFP+ K562 con il prodotto endpoint IVD o cellule NK92mi (n = 1). L'espressione delle cellule FITC+ DAPI+ è stata valutata con un analizzatore cellulare e l'analisi dei dati è stata eseguita con software compatibile. (A) Un grafico FACS rappresentativo che mostri il gating di sottoinsiemi FITC + DAPI + dalla cocoltura di prodotti IVD e cellule K562 con un rapporto E/T di 1. (B) Singoli appezzamenti dell'esperimento di cocoltura con prodotti GFP+ IVD (a sinistra) o cellule NK92mi (a destra) per 3 ore. Entrambi riflettono una relazione proporzionale positiva tra la percentuale di cellule morenti e il rapporto E:T. (C) Un grafico che mostra le curve di uccisione dei prodotti IVD e delle celle NK92mi sulla stessa scala. I prodotti IVD hanno mostrato una lieve citotossicità rispetto alle cellule NK92mi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1: Saggio funzionale di cellule NK da hEPSC. (A) Istogramma FACS di cellule K562 trasdotte. Le cellule FITC+ K562 esprimevano GFP. (B) istogrammi FACS dalla cocoltura di cellule GFP+ K562 e prodotti IVD endpoint a tre rapporti E:T (n = 1). Le percentuali di cellule FITC+ nella cocoltura corrispondevano al numero di cellule K562 trasdotte aggiunte. I gatings sono stati stabiliti con cellule K562 non trasdotte. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Differenziazione dei progenitori linfoidi in coltura 2D rispetto a coltura 3D. L'attuale protocollo basato su organoidi è stato utilizzato per indurre progenitori linfoidi da cellule staminali umane espanse potenziali. Sono state create due condizioni: (1) i progenitori linfoidi sono stati tenuti in coltura all'interno degli organoidi (3D) e (2) i progenitori linfoidi sono stati isolati e tenuti sul piatto di coltura (2D). Dopo 2 settimane di coltura aggiuntiva, i numeri delle cellule sono stati determinati per confrontare la coltura 2D rispetto alla coltura 3D. Clicca qui per scaricare questo file.
Ci sono alcuni passaggi fondamentali per garantire il successo della differenziazione delle cellule CD45 + CD56 + da hEPSC. La pre-differenziazione (fase 1.2) è cruciale poiché il mezzo EPSC contiene inibitori dell'impegno di lignaggio1. Dopo la pre-differenziazione, le colonie a forma di cupola di hEPSC vengono appiattite (Figura 2B). L'aggiunta di Y27632, un inibitore della Rho-chinasi (ROCKi), durante la formazione di EB da hEPSCs (step 1.3) è indispensabile per la sopravvivenza delle hEPSCs dopo la dissociazione. Un'altra considerazione importante è il numero di EB piantati su ciascun pozzo transwell. Poiché si tratta di un sistema su piccola scala, da due a tre EB per transwell è la densità ottimale per prevenire il consumo eccessivo del fluido. L'interfaccia aria-liquido viene mantenuta durante l'intero corso della differenziazione delle cellule NK per il sistema 3D, che si ritiene mantenga la polarità delle cellule stromali e supporti l'espansione dei progenitori ematopoietici derivati dall'AGM14,15.
Come accennato in precedenza, la densità di EB sul transwell è un fattore determinante per una differenziazione di successo. Il segno chiave per questo è il colore del mezzo 1 giorno dopo l'impianto di EB sul transwell. Se il colore diventa giallo rapidamente, ciò indica contaminazione o sovraffollamento. Per risolvere il problema, è necessario utilizzare una pipetta da 1 mL per prelevare manualmente EB aggiuntivi e trasferirli in un altro transwell.
Una delle principali limitazioni di questo protocollo è la purezza delle cellule CD3−/CD45+ CD56+ nei prodotti IVD, che si ritiene sia parzialmente responsabile della citotossicità inferiore rispetto alle cellule NK92mi pure. Un sistema di coltura 3D è stato impiegato per indurre progenitori ematopoietici attraverso la generazione di un EB che assomiglia ai tre strati germinali embrionali. Questa strategia imita lo sviluppo delle cellule del sangue nel microambiente del midollo osseo, eliminando così la necessità di cellule stromali per supportare la differenziazione3. Senza una fase di selezione per purificare i progenitori ematopoietici, si prevede che la purezza dei prodotti IVD sarà ridotta. Una strategia per mantenere la complessa nicchia di differenziazione aumentando al contempo la purezza del prodotto endpoint sta sviluppando un metodo di espansione per i prodotti IVD CD3-CD56+ selezionati. Ad esempio, i prodotti IVD CD3-CD56+ selezionati possono essere coltivati su cellule presentanti l'antigene artificiale (aAPC), come le cellule K562 irradicate ingegnerizzate con IL-21 legata alla membrana. Con la fornitura di IL-2 nella coltura, questo metodo può ottenere un aumento di 1.000 volte del numero di cellule NK3.
Un'altra limitazione è l'accesso limitato alle cellule NK umane in buona fede come riferimento positivo. NK92mi è il riferimento positivo impiegato nel saggio di cocultura, ma non è abbastanza accurato. Le cellule NK92mi sono ingegnerizzate da cellule NK92, una linea cellulare permanente che esprime i fenotipi16 delle cellule NK attivate, per produrre autonomamente IL-2 per soddisfare i requisiti di coltura. Le cellule NK92 dimostrano un'attività di uccisione superiore contro le cellule K562 in vitro rispetto alle cellule NK primarie umane17. Un confronto più equo della capacità di uccidere il tumore dei prodotti IVD potrebbe essere ottenuto analizzando la citotossicità delle cellule NK del sangue periferico in parallelo, ma sfortunatamente manca l'accesso alle banche del sangue.
Questo protocollo di coltura a due sistemi mira a generare cellule CD3−/CD45+CD56+ da hEPSC. La valutazione dei marcatori di superficie e della citotossicità con FACS può essere eseguita di routine su cellule da sistemi 2D senza interrompere la nicchia di differenziazione. Nonostante le differenze nelle percentuali delle cellule CD3-CD56+, i sistemi 3D e 2D possono derivare cellule CD3-CD56+ con variazioni simili nell'espressione di CD56 (Figura 3) e il sistema 2D riflette l'esistenza di progenitori linfoidi dalla condizione di coltura 3D.
Il significato dell'utilizzo del sistema di coltura 3D è che consente l'uso di saggi di profilazione ad alta risoluzione, come la trascrittomica spaziale o la spettrometria di massa di imaging, per ricercare le relazioni spaziali e le interazioni cellula-cellula all'interno della complessa nicchia di differenziazione.
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Vorremmo ringraziare il Dr. Handi Cao, Sanxing GAO, David Xiang, Yiming Chao, Ritika Jogani, Owen Chan, Stephanie Cheung e Celine Chan per la loro assistenza tecnica e le utili discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto dal Platform Technology Fund. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
30 w/v% Albumin Solution, from Bovine Serum(BSA), Fatty Acid Free | Wako Chemicals | 017-22231 | For resuspending cytokines. |
ACCUMAX | STEMCELL Technologies | 07921 | |
Anti-human-CD159a-PE | BD | 375104 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
Anti-human-CD3-APC antibodies | BD | 555355 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 2% FBS) |
Anti-human-CD45-APC antibodies | BD | 555485 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 3% FBS) |
Anti-human-CD56-PE antibodies | BD | 555516 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 4% FBS) |
Anti-human-CD56-PEcy7 antibodies | BD | 335826 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
Anti-human-CD94-APC | BD | 559876 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Thermo Scientific | 11772644 | |
Cd244 Monoclonal Antibody (eBioC1.7 (C1.7)), Functional Grade, eBioscience | Thermo Scientific | 16-5838-85 | |
Costar 6.5 mm Transwell, 0.4 µm Pore Polyester Membrane Inserts | STEMCELL Technologies | 3470 | |
Dapi Solution, 1 mg/mL | BD | 564907 | It is resuspended with ddH2O so the concentration is 10 µM/mL. Add 1 µL of the aliquot in 300 µL of FACS buffer (PBS + 2% FBS) |
DMEM | CPOS-Bioreagent core | 11965092 | |
DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11320033 | |
FcX, human | Biolengend | 422302 | |
Fetal Bovine Serum(FBS) qualified E.U.-approved South America | CPOS-Bioreagent core | 10270106 | |
FlowJo v10.8.0 | BD | ||
Gibco PBS (10x) pH 7.4 | CPOS-Bioreagent core | 70011044 | 10x concentrated PBS is manufactured as follows: without calcium, magnesium or phenol red |
K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
Knockout Serum Replacement | Thermo Scientific | 10828-028 | |
MyeloCult H5100 medium | STEMCELL Technologies | 5150 | |
NK92mi cells | ATCC | CRL-2408 | Lot: 70045208. Once thawed, they are cultured in MyeloCult H5100 medium, and maintained the density between 2 x 105 to 1 x 106 cell/mL. |
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 12 well plate | Thermo Scientific | 150628 | flat bottom |
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 24 well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
Nunc EasYDish Dishes | Thermo Scientific | 150460 | |
pLenti-GFP Lentiviral Control Vector | CELL BIOLABS | LTV-400 | It is packaged as the manufactuer suggested (https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/LTV-400-gfp- lentiviral-plasmid.pdf). 40 μL of 50x lentivirus is added with 1 μL 10 mg/mL polybrene per 1 mL of cell suspension. Complete medium change is performed 24 h after the addition of lentivirus. Cells are incubated undisputedly for 3 days at 37 °C, 5% CO2. |
Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | |
Recombinant Human Flt-3 Ligand/FLT3L Protein | R&D Systems | 308-FK-005 | It is resuspend with PBS + 0.2% BSA. Thr working concentration is 10 ng/mL or 12 IU/mL. |
Recombinant Human IL-15 Protein | R&D Systems | 247-ILB-005 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 10 ng/mL or 4500 IU/mL. |
Recombinant Human IL-18/IL-1F4 Protein | R&D Systems | 9124-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL. The IU is not provided by the company. |
Recombinant Human IL-2 Protein | R&D Systems | 202-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL or 455 IU/mL. |
Recombinant Human IL-3 Protein, 50ug | PeproTech | 200-03 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 5 ng/mL or 14 IU/mL. |
Recombinant Human IL-7 Protein | R&D Systems | 207-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 8800 IU/mL. |
Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 26 IU/mL. |
STEMdiff Hematopoietic Kit | STEMCELL Technologies | 5310 | Medium A: 45 mL STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement A ; Medium B: 75 STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement B |
StemSpan lymphoid differentiation coating material | STEMCELL Technologies | 9950 | It is resuspended in PBS (100x) |
StemSpan NK cell differentiation medium | STEMCELL Technologies | 9960 | It is prepared by adding 500 µL StemSpan NK Cell Differentiation Supplement (100x) into 49.5 mL of SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. |
StemSpan lymphoid expansion medium | STEMCELL Technologies | 9960 | It is prepared by adding 5 mL StemSpan Lymphoid Progenitor Expansion Supplement (10x) into 45 mL of StemSpan SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. |
StemSpan NK Cell Generation Kit | STEMCELL Technologies | 9960 | Thaw the medium and materials in room temperature and the medium is stored in 4 °C once thawed. |
The BD LSRFortessa cell analyzer | BD | ||
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific | 25300054 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | working concentration: 10 µM |
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