Geração de células assassinas naturais a partir de células-tronco de potencial expandido humano

Resumo

O presente protocolo mostra como diferenciar células CD3−/CD45+CD56+ com citotoxicidade leve de células-tronco potenciais expandidas humanas (hEPSCs) em condições de cultura 3D e 2D. Isso permite a validação fenotípica de rotina sem a destruição do microambiente complexo.

Resumo

A diferenciação de células natural killer (NK) de células-tronco pluripotentes humanas permite a pesquisa e a fabricação de produtos celulares de grau clínico para imunoterapia. Descrito aqui está um protocolo de duas fases que usa um meio comercial livre de soro e um coquetel de citocinas (interleucina [IL]-3, IL-7, IL-15, fator de células-tronco [SCF] e ligante tirosina quinase 3 semelhante à FMS [Ftl3L]) para diferenciar células-tronco de potencial expandido humano (hEPSCs) em células que possuem propriedades de células NK in vitro com tecnologia de cultura 3-dimensional (3D) e 2-dimensional (2D). Seguindo este protocolo, as células NK CD3−CD56+ ou CD45+CD56+ são geradas de forma consistente. Quando cocultivados com alvos tumorais por 3 h, os produtos diferenciados exibem citotoxicidade leve em comparação com uma linhagem celular permanente independente de IL-2, células NK92mi. O protocolo preserva a complexidade do microambiente de diferenciação pela geração de estruturas 3D, facilitando assim o estudo das relações espaciais entre as células imunes e seus nichos. Enquanto isso, o sistema de cultura 2D permite a validação fenotípica de rotina da diferenciação celular sem prejudicar o delicado nicho de diferenciação.

Introdução

Em comparação com as células-tronco pluripotentes convencionais, como as células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e as células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs), as células-tronco de potencial expandido humano (hEPSCs) estão mais próximas do estado de totipotência, pois podem se diferenciar em linhagens extraembrionárias e embrionárias¹. Por exemplo, as hEPSCs podem ser diferenciadas em trofoblastos¹ e células semelhantes a sacos vitelinos². Para alcançar a potência única das hEPSCs, um blastômero individual é cultivado em um meio contendo várias moléculas pequenas que inibem a sinalização de comprometimento de linhagem¹, que é referida como meio EPSC (EPSCM). A cultura de hESCs e hiPSCs no EPSCM expande sua potência anteriormente restrita para diferenciá-los em células trofoblastas¹.

As células-tronco pluripotentes são uma valiosa ferramenta de pesquisa para experimentar novas modificações genéticas. Devido às capacidades de auto-renovação e diferenciação de células-tronco pluripotentes, um clone transformado de uma célula-tronco pluripotente pode produzir produtos celulares diferenciados que possuem a mesma modificação genética no mesmo locus. Zhu e Kaufman estabeleceram o padrão para diferenciação de células NK de células-tronco pluripotentes convencionais (hESCs e hiPSCs)³. Primeiro, eles induziram células-tronco hematopoiéticas (HSCs) de um corpo embrionário derivado de células-tronco pluripotentes. A adição de fator de células-tronco (SCF), ligante tirosina quinase 3 semelhante à FMS (Ftl3L), interleucina (IL)-7, IL-15 e um suplemento inicial de IL-3 enviesaram os HSCs para se desenvolverem em células natural killer (NK). Posteriormente, expandiram as células NK com células apresentadoras de antígenos artificiais (aAPCs), que apresentam IL-21 ligada à membrana, com a suplementação contínua de IL-2. Pesquisadores têm aplicado essa abordagem à imunoterapia para gerar células natural killer derivadas de iPSC dotadas do receptor de antígeno quimérico (CAR-iNK)⁴.

As células NK humanas são definidas como leucócitos CD3−CD56+ no sangue periférico. São efetores contra células infectadas por vírus e células tumorais⁵. Alguns receptores inibitórios em células NK reconhecem moléculas expressas onipresente em células normais. Como exemplo, o heterodímero NKG2A/CD94 expresso em células NK reconhece moléculas MHC classe I⁵. Enquanto isso, os receptores ativadores nas células NK reconhecem ligantes induzidos por estresse, como o NKG2D reconhece a sequência A RELACIONADA A POLIPEPTÍDEOS MHC CLASSE I induzida por transformação A (MICA/MICB)⁶. Algumas células transformadas regulam negativamente seus "autoligantes" para escapar da vigilância imunológica e regulam positivamente os ligantes aberrantes, o que aciona as células NK para executar sua maquinaria lítica. As habilidades antitumorais intrínsecas das células NK chamaram a atenção para esse tipo de célula imune.

A capacidade de dar origem simultaneamente a linhagens embrionárias e extraembrionárias pode tornar as hEPSCs uma recapitulação mais fiel do nicho de desenvolvimento embrionário do que as células-tronco pluripotentes convencionais. Por experiência, é mais fácil manter a potência dos hEPSCs do que os hiPSCs. No presente estudo, foi desenvolvido um protocolo (Figura 1) para enviesar hEPSCs para evoluir para linhagens hematopoiéticas e, posteriormente, diferenciar células progenitoras em células natural killer (NK) in vitro. No protocolo, meios comerciais são empregados para evitar inconsistências séricas, seguidos da adição gradual de citocinas para enviesar a diferenciação em linhagens linfoides. Este protocolo tem dois sistemas para preservar o complexo microambiente 3D enquanto deriva células CD3−CD56+/CD45+CD56+ que fenotipicamente e funcionalmente se assemelham a células NK humanas.

Este protocolo pode ser útil no estudo da interação de células imunes com seus nichos de diferenciação e pode ter o potencial de purificar produtos celulares para usos imunoterapêuticos.

Protocolo

O presente estudo envolveu experimentos in vitro ; portanto, a aprovação ética não é aplicável. As linhagens celulares estabelecidas utilizadas neste estudo foram obtidas de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).

1. Geração de estruturas organoides 3D a partir de hEPSCs

1. Manter hEPSCs cultivando-os com 1 mL de meio EPSC (placa de 12 poços) em células alimentadoras SNL¹.
   NOTA: Colônias em forma de cúpula são observadas (Figura 2A) se sua potência expandida permanecer.
2. Realizar a pré-diferenciação das hEPSCs.
   1. Remova o meio hEPSC e adicione 1 mL de meio DFK (DMEM/F12 + meio de reposição sérica a 10%, consulte a Tabela de Materiais). Incubar durante 2-3 dias a 37 °C e 5% de CO₂. Realize uma mudança média no segundo dia se continuar a incubação por 3 dias.
      NOTA: Ao microscópio, as colônias em forma de cúpula são achatadas (Figura 2B).
3. Verificar a formação de corpos embrionários pela técnica de queda suspensa ^7,8.
   1. Retire o meio DFK e lave com 1 mL de PBS uma vez. Adicionar 500 μL de tripsina a 0,05% e incubar a placa a 37 °C e 5% de CO₂ por 3-7 min com base na morfologia.
      NOTA: Os hEPSCs devem poder ser separados das células do alimentador quando a placa é ligeiramente perturbada.
   2. Remova a tripsina e adicione 2 mL de meio DFK para colher as células. Gire as células a 300 x g durante 3 minutos à temperatura ambiente.
   3. Remova o sobrenadante com uma pipeta. Adicione 1 mL de meio DFK e 1 μL de Y27632 (ver Tabela de Materiais) para ressuspender as células por agitação.
   4. Conte o número de células dentro da suspensão celular com um hemocitômetro⁹. Diluir a suspensão celular com meio DFK e Y27632 (1.000x) para que haja 4.000 células/25 μL de meio DFK.
   5. Encha a tampa de uma placa de Petri de 10 cm com cerca de 30-40 gotas de 25 μL de suspensão celular por tampa. Despeje um pouco de PBS no prato inferior para evitar a evaporação das gotículas. Inverta suavemente a tampa e cubra o prato. Incubar o prato a 37 °C e 5% de CO₂ durante 3 dias.

2. Mesoderma e padronização hemato-endotelial do corpo embrionário (EB)

1. Colete EBs dentro da gota.
   1. Colete todos os EBs da gota em um tubo de 15 mL usando uma pipeta de 1 mL e um pouco de PBS. Bombeie um pouco de PBS para a gota e, em seguida, aspirar o meio, incluindo os EBs, com a pipeta.
      NOTA: As gotículas que são mais amarelas indicam mais formação e crescimento bem sucedidos do que as gotículas rosas.
   2. Gire os EBs coletados a 100 x g por 1 min à temperatura ambiente e use uma pipeta para remover o sobrenadante. Adicione 1 mL de meio A (de um kit de diferenciação celular comercialmente disponível, consulte a Tabela de Materiais) para transferir os EBs coletados para uma placa de 24 poços não aderente. Rotule este dia como Dia 0 (Figura 1).
      NOTA: Normalmente, todos os EBs coletados de um prato de 10 cm são agrupados e transferidos para um poço de uma placa de 24 poços.
2. Realizar a padronização mesodérmica dos EBs.
   1. Incubar a placa durante 3 dias a 37 °C com 5% de CO₂. No dia 2, remova 500 μL do meio A (do kit, etapa 2.1.2), evitando pipetar os EBs. Em seguida, adicione 500 μL de meio fresco A.
3. Realizar especificação hemato-endotelial do corpo embrionário.
   1. Remova 700 μL de meio A do poço e adicione 700 μL de meio B (do kit, etapa 2.1.2). Cultura por 7 dias. Realize uma meia-mudança do meio B no Dia 5, Dia 7 e Dia 9.

3. Diferenciação de células NK

1. Transfira os EBs padronizados para uma interface ar-líquido.
   1. Incline ligeiramente a placa para que os EBs se agreguem na parte inferior. Use uma pipeta de 1 mL para remover o máximo de B médio possível, evitando os EBs.
   2. Pegue os EBs com uma pipeta aspirando o meio restante. Transfira-os para um transwell em uma placa de 24 poços (consulte a Tabela de Materiais).
      NOTA: Restrinja os números a dois a três EBs por transpoço para uma densidade ideal.
2. Realizar expansão do progenitor linfoide.
   1. Adicione 500 μL de meio NK-1 (meio de expansão linfoide comercialmente disponível + 14 UI/mL IL-3, 4.500 UI/mL IL-15, 8.800 UI/mL IL-7, 26 UI/mL SCF e 12 UI/mL ftl3L, consulte a Tabela de Materiais) ao compartimento inferior do transwell. Cultura por 14 dias, e realizar uma mudança média a cada dois dias.
3. Colha e transfira as células nos dias 7-10 para uma placa revestida.
   1. Para revestir a placa, dilua o material de revestimento (material de revestimento de diferenciação linfoide comercialmente disponível, 100x, consulte a Tabela de Materiais) em PBS. Adicionar 1 ml de solução de revestimento diluída a cada alvéolo de uma placa de 12 poços e incubar a placa a 4 °C durante a noite. Cubra a abertura da placa com filme de embalagem.
   2. Adicione 200 μL de PBS no transwell, e lentamente pipete para cima e para baixo em torno de cinco a seis vezes para colher as células liberadas dos organoides. Evite pipetar os organoides.
      NOTA: As células redondas são liberadas dos organoides continuamente (Figura 2D).
   3. Transfira a suspensão de células colhidas para um tubo de 2 mL e gire as células para baixo a 500 x g por 5 minutos à temperatura ambiente. Remova o sobrenadante com uma pipeta e adicione 1 ml de meio NK-1 (passo 3.2.1) para ressuspender as células por pipetagem.
   4. Retire toda a solução de revestimento do poço e lave cada poço de uma placa de 12 poços com 1 mL de PBS duas vezes.
   5. Divida as células colhidas na proporção de 1:2. Transferir a suspensão celular para uma placa revestida de 12 poços (passo 3.3.1). Adicione 1 mL de meio NK-1 para que cada poço tenha 1,5 mL de meio.
   6. Para realizar uma mudança de meio, deixe as células sentadas por 1-2 minutos para permitir que as células afundem até o fundo. Aspirar cuidadosamente 750 μL de meio. Gire o sobrenadante coletado a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente.
   7. Descarte a maior parte do sobrenadante e ressuscite em 750 μL de meio NK-1 com pipetagem de cinco a seis vezes. Adicione as células ressuspensas no meio fresco ao poço original.
      NOTA: Este sistema paralelo é referido como o sistema 2D na Figura 1. Siga o cronograma de mudança média do poço dos organoides dos quais as células se originaram.
4. Execute a maturação da célula NK seguindo as etapas abaixo.
   1. Remova o meio antigo do sistema 3D e adicione 500 μL de NK-2 (meio de diferenciação de células NK comercialmente disponível + 4.500 UI/mL IL-15, 8.800 UI/mL IL-7, 26 UI/mL SCF e 12 UI/mL ftl3L, consulte a Tabela de Materiais) no compartimento inferior do transwell. Incubar a 37 °C e 5% de CO₂ durante 14 dias.
      NOTA: Certifique-se de que o meio está tocando a parte inferior da transwell.
   2. Execute uma mudança completa de meio nas células do sistema 2D. Recolher todos os 1,5 ml de células de um poço e centrifugar-o a 500 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Remova a maior parte do sobrenadante com uma pipeta e ressuspenda o pellet com 1,5 mL de meio NK-2 (etapa 3.4.1).
   3. Realize uma mudança média a cada dia alternado. Incline ligeiramente a placa do sistema 3D e remova todo o meio antigo fora do transwell. Adicionar 500 μL de meio NK-2 fora do transwell.
   4. Para realizar uma meia mudança de meio em um poço de uma placa de 12 poços para o sistema 2D, deixe as células sentadas por 1-2 min para permitir que as células afundem no fundo. Aspirar cuidadosamente 750 μL do meio.
   5. Gire o sobrenadante coletado a 500 x g por 5 minutos à temperatura ambiente para evitar a perda celular. Descarte a maior parte do sobrenadante e ressuspenda em 750 μL de meio NK-2 pipetando cinco a seis vezes. Adicione as células ressuspensas em meio fresco ao poço original.

4. Colheita de células maduras

1. Colha as células cultivadas no sistema 2D.
   1. Colha as células pipetando para cima e para baixo durante os dias 38-45. Lave com 1 mL de PBS duas vezes. Centrifugar a suspensão da célula a 500 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
   2. Remova o sobrenadante com uma pipeta e ressuscite-o no tampão de escolha (ou seja, PBS + 2% FBS para citometria de fluxo, consulte a Tabela de Materiais).
2. Colha as células embutidas no organoide.
   1. Recolher o meio do exterior da transwell para um tubo de 15 ml durante os dias 38-45. Lave o organoide duas vezes adicionando 200 μL de PBS dentro do transwell e pipetando para cima e para baixo cinco a seis vezes. Transfira a suspensão para o tubo de 15 mL.
   2. Adicione 500 μL de PBS em um poço de uma placa de 12 poços. Transfira o organoide do transpoço para o poço da placa de 12 poços com fórceps.
   3. Corte o organoide 20 vezes usando um par de tesouras e pinças. Lave as células restantes na pinça e tesoura no poço com PBS. Recolher o máximo de PBS possível e transferi-lo para o tubo de 15 ml utilizado no passo 4.2.1 sem aspirar a estrutura organoide.
   4. Adicionar 500 μL do reagente de dissociação (ver Tabela de Materiais) no transwell para digerir o organoide enzimaticamente. Incubar com uma solução comercial de descolamento celular (ver Tabela de Materiais) durante 7-10 min a 37 °C e 5% de CO₂. Apague a reação adicionando 1 mL de PBS com FBS a 2% e colete a solução em outro tubo de 15 mL. Lave o poço com 1 mL de PBS com FBS a 2% duas vezes.
      NOTA: Determine o comprimento da incubação com base na morfologia. Tente alcançar o ponto em que as células individuais começam a ser liberadas da membrana da estrutura 3D.
   5. Adicione 1 mL de PBS com 2% de FBS e pipeta para cima e para baixo 8-10 vezes. Recolha todas as soluções, incluindo as estruturas organoides. Transfira-os para o tubo de 15 ml utilizado na etapa 4.2.3 com um filtro celular.
   6. Centrifugar ambos os tubos a 500 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante com uma pipeta. Ressuscite o pellet celular com o tampão de escolha (etapa 4.1.2).

Resultados

Foi levantada a hipótese de que os atuais produtos de diferenciação in vitro (IVD) possuiriam marcadores de superfície e habilidades antitumorais semelhantes às células NK humanas.

O marcador definidor de células NK humanas foi acessado para testar se os produtos de diferenciação do sistema de cultura 3D produziram células que fenotipicamente se assemelhavam a células NK humanas. Cerca de 15% das células dissociadas do sistema de cultura 3D de dois lotes induzidos em diferentes momentos (n = 2) eram CD3−CD56+ (Figura 3A). O CD3 foi substituído por CD45 (um marcador pan-leucocitário) no painel de teste devido à ausência de CD3 e à dificuldade de induzir células T in vitro. Aproximadamente 16% das células dissociadas da estrutura 3D eram CD45+CD56+ (Figura 3B, n = 1), o que está de acordo com as porcentagens de células CD3−CD56+ observadas em ensaios anteriores. As porcentagens de células CD3−CD56+ nas células colhidas do sistema de cultura 2D variaram de 30% a 6%, de induções mais bem-sucedidas (Figura 3C, n = 3) a induções menos bem-sucedidas (Figura 3D, n = 2). A funcionalidade e os fenótipos das células colhidas do sistema de cultura 2D foram validados. Durante a cultura do Dia 18 do sistema 2D, cerca de 12% das células expressaram CD56 e CD107a ectópicos após 2 h de IL-18 de 50 ng/mL, IL-2 de 455 UI/mL e 20 ng/mL de estimulação de anticorpos anti-CD244 (Figura 4C, n = 1). Cerca de 28% das células colhidas eram CD94+CD159a+ (Figura 4B, n = 1). A expressão ectópica de CD107a, um revestimento proteico na membrana dos grânulos, indica degranulação¹⁰, enquanto o heterodímero CD94/NKG2A(CD159a) é outro marcador definidor das células NK. Isso fornece um exemplo da validação fenotípica e de funcionalidade de produtos IVD.

A funcionalidade dos produtos IVD foi testada por sua citotoxicidade contra células de eritroleucemia humana-células K562. O perfil abrangente do ligante em células K562 revela seu complexo histoquímico principal regulado I (MHC-I) e expressão comparativamente forte do ligante NKG2D (como ULBP-1, ULBP-2/5/6 e ULBP-3)¹¹; assim, as células K562 são suscetíveis à atividade lítica das células NK¹². Tanto os produtos de desfecho de IVD quanto as células NK92mi foram preparados com anticorpos anti-CD244 de 50 ng/mL, 455 UI/mL de IL-2 e 20 ng/mL durante a noite. As células GFP+ K562 foram cocultivadas com células colhidas de células IVD ou NK92mi em diferentes proporções efetor-alvo (E:T) na presença de 50 ng/mL (UI não fornecida) IL-18, 455 UI/mL IL-2 e 20 ng/mL anticorpos anti-CD244 no mesmo volume de meio H5100 por 3 h. A leitura da atividade de morte de células NK foi a expressão do marcador de células mortas em subconjuntos de GFP+. As células K562 foram transduzidas com um vetor de controle comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) para expressar a GFP constitutivamente, e a eficiência da transdução foi de cerca de 80% (Figura 1A Suplementar). As porcentagens de sinal de GFP adicionadas foram proporcionais ao número de células GFP+ K562 adicionadas, sugerindo expressão específica de GFP das células K562 transduzidas (Figura 1B Suplementar).

As porcentagens de células-alvo moribundas mostradas na Figura 5 foram calculadas com a seguinte fórmula¹³:

Percentagem de células moribundas = (FITC + DAPI + % de cocultura [por exemplo, Figura 5A]) - (FITC + DAPI + % de células K562 transduzidas)

De todas as três razões E:T avaliadas (0,1:1, 0,33:1, 1:1), as porcentagens de células GFP+ moribundas foram positivamente correlacionadas com as proporções E:T quando cocultivadas com produtos IVD (Figura 5B, hEPSC-NK) ou células NK92mi (Figura 5B, NK92mi), indicando a morte específica de alvos tumorais. No entanto, a citotoxicidade dos produtos de DIV foi comparativamente modesta dentro do período de tempo testado (Figura 5C).

Finalmente, a geração de células progenitoras linfoides foi comparada entre as culturas 3D e 2D. Verificou-se que a condição de cultura 3D gerou mais células progenitoras (55.000 células) do que a condição de cultura 2D (36.000 células) (Figura Suplementar 2). Isso sugere que o contexto da arquitetura tecidual e dos componentes celulares na cultura 3D apoiou a geração de células progenitoras linfoides.

Figura 1: Diagrama esquemático mostrando a estratégia de diferenciação para diferenciar células NK de hEPSCs . (A) Aqui, a linha do tempo dos sistemas de cultura 3D é mostrada, detalhando as condições de cultura e palavras-chave breves de cada etapa. A interface ar-líquido do sistema 3D é mantida durante a indução da célula NK. (B) Aqui, a linha do tempo dos sistemas de cultura 2D é mostrada. As células liberadas colhidas dos dias 7-10 de estruturas no sistema 3D são semeadas em uma placa revestida sem a interface ar-líquido. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Morfologia das células observadas em estágios distintos de diferenciação. (A) A morfologia dos hEPSCs quando mantidos em EPSCM. Os hEPSCs formam colônias em forma de cúpula. (B) A morfologia dos hEPSCs após pré-diferenciação. As colônias em forma de cúpula são achatadas. Os hEPSCs são colhidos e formam EBs com a técnica de queda suspensa. Os EBs são coletados e cultivados em meio A e depois em meio B. (C) A morfologia de um EB no Dia 10. Nesse período, o EB passa a se expandir e inflar, formando estruturas membranosas. (D) A morfologia de um EB liberador de células. Após a semeadura no transwell, o EB cresce e constantemente libera células redondas para o ambiente. Algumas das células liberadas são coletadas e cultivadas em uma placa de 12 poços revestida com materiais de revestimento de diferenciação linfoide. As populações celulares são morfologicamente heterogêneas e tendem a se agregar. (E) A morfologia das células observadas no final do IVD. Pequenas células de suspensão circulares (seta preta) são observadas. Barras de escala: (A,B,E) = 100 μm; (C,D) = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Gráficos FACS representativos de produtos derivados de hEPSC no ponto final. As células são incubadas com anticorpos conjugados com fluoroscópio no gelo por 30 min. As amostras são coradas com DAPI antes de serem carregadas na porta de injeção de amostras FACS. Células não coradas são usadas para estabelecer o gating. (A) Gráfico representativo do FACS na expressão de CD3 e CD56 em células dissociadas do sistema de cultura 3D de dois lotes (n = 2). (B) Gráfico representativo do FACS na expressão de CD45 e CD56 em células dissociadas da cultura 3D (n = 1). (C) Gráfico representativo de FACS na expressão de CD3 e CD56 em células colhidas da placa revestida de uma indução bem-sucedida (n = 3). (D) Gráfico representativo de FACS na expressão de CD3 e CD56 da placa revestida quando a indução é subótima (n = 2). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Gráfico representativo do FACS nos produtos derivados do hEPSC durante a cultura do Dia 18 (n = 1). (A) Gráfico do FACS na expressão de CD56 e CD107a após 2 h de estimulação com anticorpos IL2, IL-18 e anti-CD244. (B) Gráfico FACS na expressão CD159a e CD94. As amostras são coradas com DAPI antes de serem carregadas na porta de injeção de amostras FACS. Células não coradas são usadas para estabelecer o gating. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Gráfico das porcentagens de células moribundas contra diferentes proporções E:T da cocultura de células GFP+ K562 com o produto final IVD ou células NK92mi (n = 1). A expressão das células FITC+ DAPI+ foi avaliada com um analisador celular, e a análise dos dados foi realizada com software compatível. (A) Um gráfico FACS representativo mostrando o controle de FITC + DAPI + subconjuntos da cocultura de produtos IVD e células K562 com uma relação E:T de 1. (B) Parcelas individuais da experiência de cocultura com produtos GFP+ IVD (esquerda) ou células NK92mi (direita) durante 3 h. Ambos refletem uma relação proporcional positiva entre a porcentagem de células moribundas e a relação E:T. (C) Um gráfico mostrando as curvas de morte de produtos IVD e células NK92mi na mesma escala. Os produtos IVD apresentaram citotoxicidade leve em comparação com as células NK92mi. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 1 Suplementar: Ensaio funcional de células NK de hEPSCs. (A) Histograma FACS de células K562 transduzidas. As células FITC+ K562 expressaram GFP. (B) Histogramas FACS da cocultura de células GFP+ K562 e dos produtos IVD do desfecho em três proporções E:T (n = 1). As porcentagens de células FITC+ na cocultura corresponderam ao número de células K562 transduzidas adicionadas. As gatas foram estabelecidas com células K562 não transduzidas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 2 Suplementar: Diferenciação do progenitor linfoide em cultura 2D versus 3D. O presente protocolo baseado em organoides foi utilizado para induzir progenitores linfoides a partir de células-tronco de potencial expandido humano. Duas condições foram estabelecidas: (1) progenitores linfoides foram mantidos em cultura dentro dos organoides (3D) e (2) progenitores linfoides foram isolados e mantidos na placa de cultura (2D). Após 2 semanas de cultura adicional, os números de células foram determinados para comparar a cultura 2D versus 3D. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Existem alguns passos fundamentais para garantir a diferenciação bem-sucedida de células CD45 + CD56 + de hEPSCs. A pré-diferenciação (etapa 1.2) é crucial, uma vez que o meio EPSC contém inibidores do comprometimento da linhagem¹. Após a pré-diferenciação, as colônias em forma de cúpula de hEPSCs são achatadas (Figura 2B). A adição de Y27632, um inibidor da Rho-quinase (ROCKi), durante a formação de EBs a partir de hEPSCs (etapa 1.3) é indispensável para a sobrevivência das hEPSCs após a dissociação. Outra consideração importante é o número de EBs plantados em cada transwell. Por ser um sistema de pequena escala, dois a três EBs por transwell é a densidade ideal para evitar o consumo excessivo dos meios. A interface ar-líquido é mantida durante todo o curso da diferenciação das células NK para o sistema 3D, que se acredita manter a polaridade das células estromais e apoiar a expansão dos progenitores hematopoiéticos derivados da AGM^14,15.

Como mencionado anteriormente, a densidade de EBs no transwell é um fator determinante para uma diferenciação bem-sucedida. O principal sinal para isso é a cor do meio 1 dia após o implante de EBs no transwell. Se a cor ficar amarela rapidamente, isso indica contaminação ou superlotação. Para resolver o problema, uma pipeta de 1 mL deve ser usada para pegar manualmente EBs extras e transferi-los para outro transwell.

Uma grande limitação deste protocolo é a pureza das células CD3−/CD45+ CD56+ nos produtos IVD, que se acredita ser parcialmente responsável pela citotoxicidade inferior em comparação com as células NK92mi puras. Um sistema de cultura 3D foi empregado para induzir progenitores hematopoiéticos através da geração de um EB que se assemelha às três camadas germinativas embrionárias. Essa estratégia imita o desenvolvimento de células sanguíneas no microambiente da medula óssea, eliminando a necessidade de células estromais para suportar a diferenciação³. Sem uma etapa de triagem para purificar os progenitores hematopoiéticos, espera-se que a pureza dos produtos IVD seja reduzida. Uma estratégia para manter o nicho de diferenciação complexa enquanto aumenta a pureza do produto de endpoint está desenvolvendo um método de expansão para os produtos IVD CD3-CD56+ classificados. Por exemplo, os produtos de IVD CD3−CD56+ classificados podem ser cultivados em células apresentadoras de antígenos artificiais (aAPCs), como células K562 irradiadas projetadas com IL-21 ligada à membrana. Com o fornecimento de IL-2 na cultura, este método pode alcançar um aumento de 1.000 vezes no número de células NK³.

Outra limitação é o acesso limitado a células NK humanas de boa-fé como referência positiva. NK92mi é a referência positiva empregada no ensaio de cocultura, mas não é precisa o suficiente. As células NK92mi são projetadas a partir de células NK92, uma linhagem celular permanente que expressa fenótipos de células NK ativadas¹⁶, para produzir de forma autônoma IL-2 para atender aos requisitos de cultura. As células NK92 demonstram atividade de morte superior contra as células K562 in vitro do que as células NK primárias humanas¹⁷. Uma comparação mais justa da capacidade de matar tumores dos produtos de DIV poderia ser alcançada testando a citotoxicidade das células NK do sangue periférico em paralelo, mas, infelizmente, o acesso aos bancos de sangue está faltando.

Este protocolo de cultura de dois sistemas visa gerar células CD3−/CD45+CD56+ a partir de hEPSCs. A avaliação dos marcadores de superfície e citotoxicidade com FACS pode ser realizada rotineiramente em células de sistemas 2D sem interromper o nicho de diferenciação. Apesar das diferenças nas porcentagens de células CD3−CD56+, os sistemas 3D e 2D podem derivar células CD3−CD56+ com variações semelhantes na expressão de CD56 (Figura 3), e o sistema 2D reflete a existência de progenitores linfoides da condição de cultura 3D.

A importância de utilizar o sistema de cultura 3D é que ele permite o uso de ensaios de perfil de alta resolução, como transcriptômica espacial ou espectrometria de massa de imagem, para pesquisar as relações espaciais e as interações célula-célula dentro do complexo nicho de diferenciação.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 w/v% Albumin Solution, from Bovine Serum(BSA), Fatty Acid Free	Wako Chemicals	017-22231	For resuspending cytokines.
ACCUMAX	STEMCELL Technologies	07921
Anti-human-CD159a-PE	BD	375104	During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS)
Anti-human-CD3-APC antibodies	BD	555355	During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 2% FBS)
Anti-human-CD45-APC antibodies	BD	555485	During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 3% FBS)
Anti-human-CD56-PE antibodies	BD	555516	During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 4% FBS)
Anti-human-CD56-PEcy7 antibodies	BD	335826	During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS)
Anti-human-CD94-APC	BD	559876	During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS)
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film	Thermo Scientific	11772644
Cd244 Monoclonal Antibody (eBioC1.7 (C1.7)), Functional Grade, eBioscience	Thermo Scientific	16-5838-85
Costar 6.5 mm Transwell, 0.4 µm Pore Polyester Membrane Inserts	STEMCELL Technologies	3470
Dapi Solution, 1 mg/mL	BD	564907	It is resuspended with ddH2O so the concentration is 10 µM/mL. Add 1 µL of the aliquot in 300 µL of FACS buffer (PBS + 2% FBS)
DMEM	CPOS-Bioreagent core	11965092
DMEM/F12	Thermo Scientific	11320033
FcX, human	Biolengend	422302
Fetal Bovine Serum(FBS) qualified E.U.-approved South America	CPOS-Bioreagent core	10270106
FlowJo v10.8.0	BD
Gibco  PBS (10x) pH 7.4	CPOS-Bioreagent core	70011044	10x concentrated PBS is manufactured as follows: without calcium, magnesium or phenol red
K562 cells	ATCC	CCL-243
Knockout Serum Replacement	Thermo Scientific	10828-028
MyeloCult H5100 medium	STEMCELL Technologies	5150
NK92mi cells	ATCC	CRL-2408	Lot: 70045208. Once thawed, they are cultured in MyeloCult H5100 medium, and maintained the density between 2 x 105 to 1 x 106 cell/mL.
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 12 well plate	Thermo Scientific	150628	flat bottom
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 24 well plate	Thermo Scientific	142475
Nunc EasYDish Dishes	Thermo Scientific	150460
pLenti-GFP Lentiviral Control Vector	CELL BIOLABS	LTV-400	It is packaged as the manufactuer suggested (https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/LTV-400-gfp- lentiviral-plasmid.pdf). 40 μL of 50x lentivirus is added with 1 μL 10 mg/mL polybrene per 1 mL of cell suspension. Complete medium change is performed 24 h after the addition of lentivirus. Cells are incubated undisputedly for 3 days at 37 °C, 5% CO2.
Polybrene	EMD Millipore	TR-1003-G
Recombinant Human Flt-3 Ligand/FLT3L Protein	R&D Systems	308-FK-005	It is resuspend with PBS + 0.2% BSA. Thr working concentration is 10 ng/mL or 12 IU/mL.
Recombinant Human IL-15 Protein	R&D Systems	247-ILB-005	It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 10 ng/mL or 4500 IU/mL.
Recombinant Human IL-18/IL-1F4 Protein	R&D Systems	9124-IL-010	It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL. The IU is not provided by the company.
Recombinant Human IL-2 Protein	R&D Systems	202-IL-010	It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL or 455 IU/mL.
Recombinant Human IL-3 Protein, 50ug	PeproTech	200-03	It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 5 ng/mL or 14 IU/mL.
Recombinant Human IL-7 Protein	R&D Systems	207-IL-010	It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 8800 IU/mL.
Recombinant Human SCF Protein	R&D Systems	255-SC-010	It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 26 IU/mL.
STEMdiff Hematopoietic Kit	STEMCELL Technologies	5310	Medium A: 45 mL STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement A ; Medium B: 75 STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement B
StemSpan lymphoid differentiation coating material	STEMCELL Technologies	9950	It is resuspended in PBS (100x)
StemSpan NK cell differentiation medium	STEMCELL Technologies	9960	It is prepared by adding 500 µL StemSpan NK Cell Differentiation Supplement (100x)  into 49.5 mL of SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit.
StemSpan lymphoid expansion medium	STEMCELL Technologies	9960	It is prepared by adding 5 mL StemSpan Lymphoid Progenitor Expansion Supplement (10x) into 45 mL of StemSpan SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit.
StemSpan NK Cell Generation Kit	STEMCELL Technologies	9960	Thaw the medium and materials in room temperature and the medium is stored in 4 °C once thawed.
The BD LSRFortessa cell analyzer	BD
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Scientific	25300054
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254	working concentration: 10 µM