Per l'imaging di cellule vive di costrutti ATG9A, seminare le cellule HEK293A in due millilitri di DMEM ad alto contenuto di glucosio in un piatto di coltura tissutale da 60 millimetri fino a quando non raggiungono il 65-70% di confluenza. Il giorno successivo, preparare e aggiungere la miscela di DNA di lipofectamina alla piastra di coltura cellulare contenente quattro millilitri di terreno di coltura e far oscillare delicatamente la piastra avanti e indietro per distribuire uniformemente la miscela. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 10% di anidride carbonica.
Dopo quattro ore di trasfezione, sostituire il terreno di coltura con un terreno fresco e incubare le cellule per una notte a 37 gradi Celsius con il 10% di anidride carbonica. Il giorno successivo, tripsinizzare le cellule aggiungendo tripsina EDTA. Quindi, contare le cellule staccate e riseminarle su una piastra di coltura adatta per la microscopia dal vivo durante la notte.
Il giorno successivo, riprendi l'immagine delle cellule usando un microscopio confocale. In condizioni basali, ATG9A è localizzato principalmente nella rete di Golgi come indicato dall'immunofluorescenza della proteina endogena e si sovrappone a GM130, un marcatore cis-Golgi. ATG9A marcato con eGFP N-terminale e ATG9A marcato con mRFP N-terminale erano meno localizzati al Golgi e risiedevano principalmente nelle vescicole.
Al contrario, l'ATG9A marcato terminalmente con eGFPc è più incline ad aggregarsi all'interno della cellula. La fusione di una sequenza 3x-FLAG tra un fluoroforo N-terminale e ATG9A ha aiutato la proteina sovraespressa a comportarsi in modo simile a quella endogena. Il sovraespresso mCherry 3x-FLAG ATG9A colocalizza con il marcatore di Golgi GM130 in condizioni di alimentazione.
Questa localizzazione e il compartimento vescicolare di AG9A sono stati preservati nel tempo, permettendo lo studio spazio-temporale del traffico di ATG9A.
