Per iniziare, preparare 10 volte citrato concentrato, soluzione di recupero target o TRS di pH sei, secondo le istruzioni del produttore. Diluirlo in un rapporto di 1:10 con acqua deionizzata. Quindi riscaldare la soluzione in un barattolo di plastica per colorare a 96 gradi Celsius.
Rimuovere i vetrini dalla griglia per vetrini e metterli in una camera umida. Successivamente, pipettare una o due gocce dell'agente autofluorescente su ciascun campione di tessuto e incubare i campioni per cinque minuti. Impilare nuovamente i vetrini nel rack per vetrini e risciacquare per un minuto in etanolo al 60% con movimenti verso l'alto e verso il basso per rimuovere il reagente per la riduzione dell'autofluorescenza inutilizzato.
Immergere il rack per vetrini in acqua deionizzata per cinque minuti. Trasferire i vetrini in un barattolo di colorazione con tampone TRS preriscaldato per il recupero dell'antigene. Incubare i vetrini per 10 minuti a 96 gradi Celsius a bagnomaria.
Rimuovere il barattolo di colorazione e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente per circa 60-90 minuti. Quindi, rimuovere il TRS mantenendo i vetrini nel barattolo. Sciacquare i vetrini due volte con soluzione salina tamponata TRIS contenente lo 0,05% di Tween a pH 7,4 per tre minuti ciascuno per rimuovere eventuali residui di TRS rimanenti.
Mettere i vetrini in una camera umida. Pulire delicatamente l'acqua in eccesso dai vetrini utilizzando fazzoletti di carta, quindi circondare ogni campione utilizzando una penna barriera idrofobica per evitare che la soluzione anticorpale fuoriesca.
