Per iniziare, disporre i materiali sperimentali necessari sulla piattaforma di lavoro. Aggiungere 100 microlitri di soluzione sterile di gelatina allo 0,4% ai pozzetti di una piastra inferiore trasparente a 96 pozzetti con pareti nere. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 30 minuti.
Sotto un microscopio invertito, confermare che le cellule endoteliali in un pallone T75 sono confluenti dall'80 al 100%. Rimuovere il fluido completo DMEM dal pallone tramite aspirazione. Per lavare le cellule, aggiungere 10 millilitri di PBS e agitare delicatamente il pallone.
Sostituire il PBS con cinque millilitri di soluzione di dissociazione cellulare. Incubare il pallone a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per circa 12 minuti. Battere il pallone dopo sei minuti.
Per facilitare la dissociazione. Aggiungere cinque millilitri di terreno completo DMEM preriscaldato al pallone e mescolare la sospensione cellulare. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri, trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 50 millilitri e centrifugare a 150 g per cinque minuti.
Nel frattempo, utilizzando una pipetta da pastore collegata a un vuoto, aspirare la soluzione di gelatina dalla piastra a 96 pozzetti. Dopo la centrifugazione delle cellule, rimuovere la supernatina dal tubo senza disturbare il pellet. Utilizzando una pipetta sierologica, aggiungere otto millilitri di terreno completo di DMEM fresco alla provetta e pipettare delicatamente la sospensione per rompere il pellet cellulare.
Contare le cellule utilizzando trippen blue su un emocitometro. Aggiungere il terreno completo DMEM per ottenere una densità di 600.000 cellule per millilitro di sospensione. Mescolare la sospensione cellulare capovolgendo delicatamente il tubo.
Aggiungere la sospensione cellulare a un serbatoio per pipette multicanale da 50 millilitri. Ogni 30 secondi, agitare delicatamente il serbatoio da un lato all'altro per mescolare la sospensione e utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 100 microlitri a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti ricoperta di gelatina. Riposizionare il coperchio trasparente della piastra e scuotere delicatamente la piastra facendola scorrere sulla superficie della cappa sterile da nord a sud e da est a ovest.
Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 16-24 ore.
