Il nostro gruppo di ricerca utilizza i mitocondri come bersaglio farmacologico per lo sviluppo di diversi prodotti come chemioterapici, insetticidi, tra gli altri. Con questo video, vogliamo descrivere la metodologia per valutare gli enzimi della respirazione mitocondriale in modo più accessibile, comprensibile e utilizzabile. Nel nostro laboratorio, abbiamo stabilito un protocollo per valutare i diversi effetti degli xenobiotici sui mitocondri in ratti, zanzare e zecche, fornendo alcune informazioni su una specifica risposta mitocondriale.
Questo approccio supporta la formulazione di pesticidi bio-sicuri identificando le interruzioni bioenergetiche mitocondriali fondamentali per ridurre al minimo la tossicità non bersaglio. Il nostro vantaggio differenziale include un protocollo di progettazione di insetticidi che inizia con l'analisi in silico di migliaia di molecole, seguita dalla convalida in vitro di quelle che soddisfano i criteri di biosicurezza e si conclude con i test in vivo. Questo metodo consente di risparmiare tempo e risorse, rispettando al contempo le migliori pratiche nella produzione di pesticidi.
A medio termine, selezioneremo molecole di derivazione naturale che possono essere combinate con la modificazione genetica, mirando ai mitocondri degli insetti, puntando a una maggiore specificità e biosicurezza negli organismi non bersaglio. Per iniziare, prepara 250 millilitri di tampone di isolamento dei mitocondri con o senza 0,2 grammi di BSA. Aliquotare 10 millilitri di tampone in un tubo conico ghiacciato.
Dopo l'eutanasia di un ratto, sezionare completamente il suo fegato e metterlo nel tampone isolante ghiacciato per sciacquarlo. Dopo due lavaggi, tritare il tessuto epatico con forbici affilate in una capsula di Petri contenente 10 millilitri di tampone isolante. Posizionare la soluzione nel tubo dell'omogeneizzatore tissutale Potter-Elvehjem per omogeneizzare il tessuto tritato almeno 10 volte a una bassa velocità di 390 giri al minuto.
Quindi, trasferire la soluzione omogeneizzata in una provetta conica e centrifugare a 600 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, versare con cura il surnatante in una nuova provetta conica. Centrifugare nuovamente il surnatante a 7.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante risultante.
Risospendere il pellet mitocondriale isolato in due millilitri di tampone di isolamento senza BSA. Controlla se le uova di Aedes aegypti sono state covate in vassoi con acqua declorata filtrata una settimana prima dell'esperimento e monitora il processo di muta nelle larve. Una volta che le larve raggiungono lo stadio L3, attendere un massimo di 12 ore prima di raccoglierle.
Utilizzando una pipetta Pasteur, raccogliere almeno 100 larve di Aedes aegypti agli stadi da L3 a L4 in circa 30 millilitri di acqua priva di cloro. Dopo il filtraggio, trasferire la soluzione con le larve nel tubo omogeneizzatore tissutale Potter-Elvehjem e omogeneizzare accuratamente a circa 390 giri al minuto almeno 10 volte. Trasferire il tessuto omogeneizzato attraverso una siringa di lana di vetro per filtrare i residui di esoscheletro di grandi dimensioni.
Per iniziare, procurati mitocondri di fegato di ratto e larve omogeneizzate di Aedes aegypti L3, L4. Per il test polarografico, calibrare il respirometro ad alta risoluzione ogni giorno prima di iniziare qualsiasi test, seguendo le istruzioni del produttore. Aggiungere il mezzo di reazione alle camere, assicurandosi di un eccesso di almeno 0,2 millilitri al di sopra del volume standard della camera sperimentale di due millilitri.
Monitorare il consumo di ossigeno per misurare le attività del NADH e della succinato ossidasi dopo aver aggiunto il tampone di reazione, 0,1 milligrammi di proteine e il substrato. Attendere che il segnale della concentrazione di ossigeno si stabilizzi e registrarlo. Aggiungere inibitori delle proteine di trasporto degli elettroni alla camera per confermare che il consumo di ossigeno osservato è dovuto alla catena respiratoria mitocondriale.
Per l'attività della NADH deidrogenasi, preparare prima il sistema di reazione contenente tutti i componenti necessari e aggiungere i reagenti alla cella spettrofotometrica. Monitorare l'attività della NADH deidrogenasi con la riduzione del ferrocianuro di potassio a 420 nanometri. Utilizzare il coefficiente di estinzione molare di 1,04 per millimolare per centimetro per calcolare la concentrazione.
Infine, dividere l'attività riportata per la concentrazione proteica utilizzata per ottenere l'attività enzimatica specifica. Allo stesso modo, valutare la succinato deidrogenasi e la citocromo c reduttasi o l'attività del complesso III utilizzando miscele di reazione appropriate. Per misurare l'attività della citocromo c ossidasi o del complesso IV, preparare il sistema di reazione e miscelare quantità molari uguali di citocromo c e ditionito di sodio, garantendo una riduzione completa.
Passare la miscela ridotta attraverso una colonna di gel di destrano reticolato utilizzando il tampone fosfato come fase mobile. Quantificare le frazioni raccolte a 550 nanometri in uno spettrofotometro. Infine, calcolare la concentrazione con un coefficiente di estinzione molare di 19,8 per millimolare per centimetro, applicando la legge di Beer.
Dividi l'attività riportata per la concentrazione proteica per ottenere risultati di attività enzimatica specifica. Il cavacrolo a 9,7 parti per milione ha ridotto l'attività della NADH ossidasi di circa il 9,35%, mentre l'olio essenziale di Cymbopogon flexuosus, o EO, a 10 parti per milione ha ridotto l'ossidazione del NADH e la riduzione dell'ossigeno di circa il 34%, indicando l'inibizione nel trasporto di elettroni tra il complesso I e il complesso IV. e Cymbopogon flexuosus EO hanno ridotto l'attività della succinato ossidasi fino al 50% nei mitocondri epatici isolati di ratto, suggerendo un'inibizione tra il Complesso II e il Complesso IV.Il cavacrolo ha ridotto l'attività della citocromo c reduttasi del NADH e l'ossidazione del citocromo c e la riduzione dell'ossigeno nel complesso IV nelle larve di Aedes aegypti, mentre Cymbopogon flexuosus EO ha ridotto l'attività della citocromo c ossidasi di circa il 58% nei mitocondri epatici di ratto.
