Hammarlund laboratuarında İş tarafından finanse edilmektedir: NIH hibe R01 NS066082-01 ve T32GM007223, Beckman Vakfı ve Ellison Tıp Vakfı.

1. Sistem montajı Sisteminin belirli bileşenleri aşağıda özetlenmiştir. Doğru montaj yapıldığında, kullanıcının tek elle mikroskop odaklanmak gerekir, (ya fare, joystick ile) ile sahneye taşımak, ayak pedalı ile lazer etkinleştirin ve üzerinde net bir görüş var ekran görüntüsü. <ol><li> MicroPoint lazer epi-floresans bir bileşik mikroskop bağlantı noktasına monte edilebilir. Biz Nikon 80i kullanabilirsiniz, ancak, herhangi bir araştırma notu Dik veya ters çevrilmiş kapsamı çalışması gerekir. MicroPoint sistemi kesmek istediğiniz hücreleri etiketler fluorofor maç gereken özel bir dikroik içerecektir. Alternatif fluorophores etiketli Kesme hücreleri ek dichroics gerektirir. Ayrıca, bir darbe jeneratörü ve ayak pedalı MicroPoint sistemi ile geliyor. </li><li> 100x, 1.4 NA yağ performans cerrahi ve yenilenme değerlendirilmesi için objektif, artı slayt örnek bulmak için gerekli ek hedefler. Biz ameliyatı için bir Nikon Planı Apo VC ve 4x kaba odaklama ve örnek bulmak için yararlı olduğunu bulmak. </li><li> Joystick ile sahne Motorlu. Sahnede sadece hedefleme için kullanılan bu yana, son derece yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik ile bir aşamasında, gereksiz. Biz önce OptiScan II (tartışma) kullanın. </li><li> Kamera. Kamera, bilgisayar monitörü görüntü görselleştirme 100x amacı ile etiketlenmiş neurite, odak ve hedef yeterli bir kare hızı sağlamak için ihtiyaç. Biz axotomy prosedürü sırasında aydınlatma ışığı azaltıcı (aşağıda, 1.7 bakınız) foto ağartma veya hasar potansiyel karıştırıcı etkilerini önlemek için tercih ediyor. Böylece, fotoğraf makinesi, bu düşük ışık seviyesini karşılamak için yeterince duyarlı olması gerekir. Biz Hamamatsu Orca 05G kullanımı ve 16.3 Hz görüntüleme yeterli olduğunu bulmak. Eşdeğer kameralar yerine olabilir. </li><li> Kamera sürücü, Bilgisayar, monitör, ve görüntüleme yazılımı. Ayrıca, (tartışma), bir fare ile motorlu sahne işlemek için görüntüleme yazılımı kullanın. </li><li> Hava tablo. Bu gereklilik, yere bağlı olarak değişebilir, fakat cerrahi 100x amacı ile yapılır, titreşim izolasyonu gerekli buluyorum. </li><li> Fluorofor aydınlatan ışık kılavuzu ve obtüratör mekanizması ile Işık kaynağı. Işık kılavuzu MicroPoint eklenecektir. Obtüratör mekanizması bağımsız lazer aydınlatma yoğunluğunu azaltmak için yararlıdır. Biz önce Lümen 200 veya Leica EL6000 kullanımı ve axotomy toplam ışık yoğunluğu% 80 kadar zayıflatır. </li></ol> 2. Lazer kurulum Ayrıntılı bir protokol başlangıçta hizalayın ve lazer odak MicroPoint lazer sistemi ile sağlanmaktadır. Biz ilk kurulum prosedürü üzerine başarılı bir şekilde takip edilmiştir varsayalım. Bu lazer mercek crosshair&#39;i ile hizalayarak içerir. Burada lazer odak ve yoğunluğu düzenli bakım için bir protokol sağlar. MicroPoint kılavuzda belirtildiği gibi, darbeli azot lazer insan gözü ciddi zarar verme yeteneğine sahiptir. Bakım lazer ışını doğrudan bakmak asla alınmalıdır. Kurulduktan sonra, bariyer filtresi güvenle göz mercekleri ile radyasyon engellemeniz gerekir. Bir organizmanın nöronlar Kesme kum tanesi büyüklüğü zor olabilir. Lazer tarafından yapılan hasar alan çok küçük olduğundan, bu örnek tam hedef için üç boyutlu lazer odak konumunu bilmek şarttır. Lazer odak yansıtılmış slayt kullanılarak bulunur. İlk olarak, lazer odak z konumu görüntüleme yolunu odak eşleşen olmadığını kontrol edin. Daha sonra, hasar odak xy konumu görüntüleme yazılımı crosshair&#39;i ile işaretlenir. Z-düzlemi yoğunlaşırken <ol><li> Nötral yoğunluk filtresi ND16 (Şekil 1a) itin. Biz netleme sırasında lazer azaltmak için epi-aydınlatma yolunda nötral yoğunluk filtreleri kullanın. Daha ince odaklanarak, ND16 ve ND4 floresan filtreleri hem itin. </li><li> Anahtarı ile 1 darbe MicroPoint lazer &#39;Seç&#39; (Şekil 1b), ve daha sonra uygun bir uzun geçiş bariyer filtresi (Şekil 1c) filtre tekerleği hareket döndü. </li><li> Sahneye yansıtılan slayt yerleştirin ve iletilen ışık kullanarak 4X amacı ile içinde iğne deliği odaklanmak. </li><li> Yansıtılmış slayt bir damla immersiyon yağı ekleyin ve 100X amacı ile iğne delikleri üzerinde odaklanılması. Ile kamera deklanşör kolu (Şekil 1d) ve lazer çekim hızı (Şekil 1e) anahtarlama optik yol açın. Gerekirse iğne deliği kenarları keskin, bu yüzden iletilen ışık yoğunluğunu azaltmak: Bu tam olarak odaklama yardımcı olacaktır. </li><li> Ayak pedalı basın. Bu ayna lazer düzgün odaklı ise küçük bir delik üretmek gerekir. </li><li> Yansıtılmış slayt düzlemi biraz üstünde mikroskop Focus ve lazer tekrar ateş. Bu daha küçük yapmak gerekirilk atış daha delik, ya da hiç iz bırakmak. Yansıtılmış slayt altında yoğunlaşarak tekrarlayın. </li><li> Bir delik 2.5 veya daha büyük bir delik üretilen ayna yüzeyi altında veya üstünde duruluyor ise, lazer ablasyon baş odak halkası ile tekrar odaklayın. Delik hala düzgün merceğindeki crosshair&#39;i ile uyumlu olduğunu doğrulayın. Tutarlı kullanımı ile, z-düzlemi odak nadiren ayarlanması gerekiyor. </li></ol> Xy düzleminde yoğunlaşırken <ol start="8"><li> Yukarıda 2.3 üzerinden 2.1 adımları izleyin ve küçük bir delik ayna slayt yapmak için ayak pedalına basın. </li><li> Başlatın menüsü Elements &#39;Acquire&#39; çekim modu &#39;Canlı&#39;. &#39;Ölçü&#39; araç &#39;seçeneğini ROI editörü&#39;, sonra &#39;çift çapraz&#39; aracını seçin ve yeni deliğin merkezi ile hizalamak crosshair&#39;i sürükleyin. Ve daha sonra &#39;Çıkış editörü&#39; ROI Kaydet &#39;ve canlı çekim modu devam tıklayın. </li><li> Fare ile sahne işlemek için Elements &#39;fare XY&#39; ayarı etkinleştirin. </li><li> Nötral yoğunluk filtresi (ler), orijinal pozisyonuna (lar) geri çekin 10 lazer bakliyat ve yansıtılmış slayt kaldırmak. </li></ol> Lazer güç ayarlama <ol start="12"><li> Lazer güç seçtiğiniz nöron kesmek için gerekli olan minimum gücü ayarlanabilir olmalıdır. Yaşayan solucanlar (aşağıda açıklanmıştır) kesim ise zayıflatıcı plaka (Şekil 1f) hareket ederek güç ayarlayın. Lazer gücü çok yüksek ise, bu çevresel hasara neden olan veya solucan bir delik patlama olacak. Lazer gücü çok düşükse, nöron sever. Sistem kurulduktan sonra, zayıflatıcı pozisyonu nadiren değiştirilmesi gerekir. Lazer zayıflarsa, zayıflatıcı plaka kesme devam taşındı ihtiyacı varsa, boya hücre boya değiştirilmesi gerekir (bakınız tartışma) bir işareti olabilir. </li></ol> 3. Solucanlar hareketsiz <ol><li> % 3 M9 erimiş agaroz, 22mm KH2PO4, 42mm Na2HPO4, 85mm NaCl, 1mm MgSO4 bir çözüm hazırlayın. Erimiş agaroz 5 ml, 15 ml şahin tüp içine koyun. Başka bir tüp su ile doldurun. Modüler bir gözü Yeri tüpler 55 ° C&#39;ye kadar Her tüp için mini su banyoları oluşturmak için gözü su ile doldurun. Not: agaroz büyük miktarlarda önceden hazırlanan ve daha sonraki deneyler için yeniden erimiş olabilir. </li><li> Etiketleme bant her iki slaytlar ve bu slaytları arasında temiz bir slayt iki kat yerleştirin. Temiz slayt ve sonucu agaroz pad (Şekil 2) iki adet bant kalınlığı, böylece ilk yer dik başka bir slayt ortasında plastik bir ampul pipet kullanarak agaroz bir damla koyun. 30 saniye sonra yastık iki slaytları teker teker çıkarın. Durulayın ve plastik pipet sonraki slaytlar ile kullanmak için, su dolu bir şahin tüp içinde saklayın. </li><li> Sonra, yer 3-5 ped merkezinde 0.10 mm veya 0.05 mikron polistiren boncuklar mcL. 5-10 solucanlar ilgi nöronların floresan proteini ifade ekleyin. Ilgi nöronların asimetrik solucanın sağ veya sol tarafında dağıtılan platin alma, solucanlar doğru tarafı yukarı bakacak şekilde çevirmek için kullanın. Worms agaroz pedleri hazırlanması 10 dakika içinde slaytlar konulmalıdır. </li><li> Solucanlar bir kapak kayma dikkatlice yerleştirin. Kapak kayma yerleştirildikten sonra, bu manikür bozabilir ve solucanları yok edecektir agaroz pad göre hareket yok. Mikroskop aşamasında hazırlanan slayt yerleştirin. </li></ol> 4. Kes nöronlar <ol><li> Optik yol geçiş kolu ile göz mercekleri içine doğrudan güneş ışığı. 4X amacı ile kesilebilir solucan odaklanın kapak astar üzerine petrol bir damla yerleştirin ve 100X amacı geçmek. Kamera optik yol dönün. </li><li> Crosshair&#39;i merkezinde altında seçtiğiniz nöron taşımak için fareyi kullanın. Lazer yangın ayak pedalına basın ve nöronal süreci sever. Gerekirse, bakliyat iki takım nöron koparmak için kullanılabilir. İlk başta, bu nöronların sonraki rejenerasyon değerlendirmek için bireysel solucanlar kesilmiş sahip olduğu tam olarak takip etmek için yararlı olur. Doğru yapıldığında, lazer axotomy çevresindeki cilt dokusu veya diğer nöronların (bkz. Şekil 3) önemli bir hasara neden olmadan, nöron küçük bir mola üretir. Bazı durumlarda, küçük bir iz, site çevresinde yaralanma meydana gelebilir. </li><li> Solucanlar agaroz pad üzerinde kalmasını dikkatli olmak, doğrudan yukarı doğru hareketi kapak kayma kaldırarak solucanlar kurtarın. Lamel kapalı slayt yapmayın. Sonra, iğne burun forseps ile solucanlar etrafında ped kesmek ve OP50 8 içeren taze bir numaralı seribaşı NGM plaka agaroz bölümüne yerleştirin . Boncuk solucanlar ücretsiz ve agaroz kaldırmak için steril M9 10 mcL pad üzerinde yerleştirin. </li></ol> 5. Puan nöron rejenerasyonu için <ol><li> Agaroz adım 2.2 &#39;de belirtildiği gibi, dolgusunu hazırlayın. </li><li> 3-5 ve Yeri solucanlarmu; polistiren boncuklar L. Lamel uygulayın. Slaytlar sırayla hazırlıklı olmak, ya da alternatif tüm solucanlar, avans ve 10 cm kültür yemekleri, her agaroz nemli tutmak için nemli bir Kimwipe içeren muhafaza slaytlar hazırlanmış olabilir. </li><li> 100X amacı kopmuş nöronlar görselleştirmek için kullanın. Birçok nöronlar, kesme sitesi distal nöronal güdük kalacaktır. Biz bu kalıntının varlığı gerçekten nöron (Şekil 4) kopmuş olduğunu bir göstergesi olarak kullanırlar. Bu güdük varlığı kesmeyin kesilen ve yeniden bir nöron ayırt etmek mümkün kılar. Not: her iki distal ve proksimal kütükleri başlangıçta kesildikten sonra geri çekin. </li><li> Rejenerasyon değerlendirin. Çeşitli parametreler tespit edilebilir. Bir basit test yaralı nöron bir büyüme konisi oluşmuş (Şekil 4a) ve (Şekil 4b) rejenere olup olmadığını, ya da. Alternatif olarak, neurite süresini izlenebilir ve karşılaştırılabilir. </li></ol> 6. Temsilcisi sonuçları Bir örnek olarak, γ-amino butirik asit (GABA), motor nöronların yenilenme karakterizasyonu açıklar. Bu nöronlar ventral sinir kablosunu ikamet ve dorsal sinir kablosu dairesel süreçleri uzatmak, 9 doğru hareketlilik için gereklidir. GABA nöronlar unc -47 veya unc -25 rehberleri (C. elegans Genetik Merkezi&#39;nden suşlar sırasıyla EG1285 ve CZ1200, kontrol altında, yeşil floresan proteininin (GFP), genetik olarak kodlanmış bir florofor ifade ederek görüntülenebilmekte .) Dağı L4-aşamada solucanlar açıklandığı gibi, solucanlar, sağ tarafta GABA nöronlar bakacak şekilde çevirin ve kapağı kayma bir yer. Dorsal ve ventral kabloları arasında her solucan, yarıda arka commissures 1-3 kesin. Ile çapraz veya bu gibi diğer commissures, salkımlı sonra puanı zor olduğunu commissures kesme kaçının. Açıklandığı gibi solucanlar kurtarın. Başarılı axotomy 18 ila 24 saat sonra, solucanlar, ameliyat sonrası iyileşti ve normal lokomotor ve yumurtlama davranışlar sergilemek olacaktır. Ölü ya da hasta olan solucanlar atın. Açıklandığı gibi kalan remount ve yenilenme değerlendirmek. Biz genellikle başına en az 30 kesilmiş nöronlar deneysel durumu değerlendirmek üzere hedefliyoruz. OxIs12 hayvanlarda genellikle kopmuş L4 GABA nöronların% 60-70 oranında bir büyüme konisi yapısı, bir ucu ve birkaç neurite şube uzantısı membran genişletilmesi ve kesme sitesi (Şekil 4a) göç kanıtladığı başlatmışlardır. Birçok durumda, büyüme konileri, dorsal sinir kablosu, bir komşu nöronal komissür ya da distal güdük yeniden göç etmiş. Nöron Geriye kalan% 30 ya axotomy site proksimal güdük oluşturan büyüme başlattık, ya da sadece küçük filopodia (Şekil 4b) genişletilmiş olacak. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. UV lazer axotomy sistemi darbeli. Özgül bileşenleri şunlardır: (a) ND filtre, (b) darbe seçici (c) filtre tekerleği kolu (d), kolu (e) lazer deklanşör ve (f) zayıflatıcı plaka geçiş optik yol. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. Agaroz ped hazırlanması. Istenilen kalınlıkta bir agaroz yastık hazırlamak için, iki kat bant (yeşil) iki slaytlar üzerine yerleştirilir. Bir slayt ilk iki arasına yerleştirilir ve agaroz bir damla, sonra temiz bir slayt eklenir. Son olarak, dördüncü bir slayt, iki adet bant kalınlığı, bir yastık içinde ilk üç dik olarak yerleştirilir. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3. Temsilcisi GABA nöron axotomies. Tipik bir deneyde, GABA nöron commissures solucanın lateral ortasında kesilmiş. Hemen önce (sol panel) ve (sağ panel) axotomy sonra kopmuş komissür gösterilmiştir. Tüm görüntüler 100X petrol amacı ile alınmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4. GABA nöron axotomies Temsilcisi sonuçlar. 24 saat sonrası axotomy kopmuş aksonların rejenerasyonu için attı. (A) olmayan rejenere akson (b) (ok) proksimal güdük olarak görülür bir büyüme konisi (ok) ile rejenere akson gösterilmiştir. Her kesim aksonun distal güdük her paneli (ok ucu) gösterilir ve akson kopmuş olduğunu bir göstergesidir.

<ol>
	<li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway.">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li><li>Ghosh-Roy, A., Wu, Z., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+Cyclic+AMP+Promote+Axonal+Regeneration+in+Caenorhabditis+elegans+and+Require+DLK-1+Kinase.">Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase.</a> Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage,+ephrin+signaling,+and+synaptic+branchi+ng.">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branchi ng.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 15132-15137 (2007).</li><li>Yan, D., Wu, Z., Chisholm, A. D., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DLK-1+Kinase+Promotes+mRNA+Stability+and+Local+Translation+in+C.+elegans+Synapses+and+Axon+Regeneration.">The DLK-1 Kinase Promotes mRNA Stability and Local Translation in C. elegans Synapses and Axon Regeneration.</a> Cell. 138, 1005-1018 (2009).</li><li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+Functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: Functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li><li>Gabel, C. V., Antoine, F., Chuang, C., Samuel, A. D. T., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nanosecond+laser+axotomy:+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport.">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Optics Express. 16, 9884-9894 (2008).</li><li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nanosecond+laser+axotomy:+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport.">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Optics Express. 16, 9884-9894 (2008).</li><li>Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nematode+Caenorhabditis+Elegans.">The Nematode Caenorhabditis Elegans.</a> , (1988).</li><li>McLntire, S. L., Jorgensen, E., Kaplan, J., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GABAergic+nervous+system+of+Caenorhabditis+elegans.">The GABAergic nervous system of Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364, 337-341 (1993).</li><li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in.">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in.</a> C. elegans. Optics Express. 15, 8521-8531 (2007).</li><li>Chung, S., Mazur, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+ablation+of+neurons+in+C.+elegans+for+behavioral+studies.">Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies.</a> Applied Physics A: Materials Science &#38; Processing. 96, 335-341 (2009).</li><li>Steinmeyer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+femtosecond+laser+microsurgery+system.">Construction of a femtosecond laser microsurgery system.</a> Nature Protocols. 5, 395-407 (2010).</li><li>Wang, Z., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+axon+regeneration.+Current+Opinion+in+Neurobiology.">Genetic dissection of axon regeneration. Current Opinion in Neurobiology.</a> , (2010).</li><li>Huang, X., Cheng, H. -. J., Tessier-Lavigne, M., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAX-1,+a+Novel+PH/MyTH4/FERM+Domain+Cytoplasmic+Protein+Implicated+in+Netrin-Mediated+Axon+Repulsion.">MAX-1, a Novel PH/MyTH4/FERM Domain Cytoplasmic Protein Implicated in Netrin-Mediated Axon Repulsion.</a> Neuron. 34, 563-576 (2002).</li><li>McIntire, S. L., Reimer, R. J., Schuske, K., Edwards, R. H., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+vesicular+GABA+transporter.">Identification and characterization of the vesicular GABA transporter.</a> Nature. 389, 870-876 (1997).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser microsurgery in C. elegans in Methods in Cell Biology: Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , .</li><li>Guo, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies.">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nature Methods. 5, 531-533 (2008).</li><li>Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-cellular+precision+on-chip+small-animal+immobilization,+multi-photon+imaging+and+femtosecond-laser+manipulation.">Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation.</a> Lab on a Chip. 8, 653-656 (2008).</li><li>Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F., F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+on-chip+high-throughput+whole-animal+sorting+and+screening+at+subcellular+resolution.">Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 13891-13895 (2007).</li><li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans.">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab on a Chip. 7, 1515-1523 (2007).</li><li>Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+the+analysis+of+behavior,+nerve+regeneration,+and+neural+cell+biology+in+C.+elegans.">Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19, 561-567 (2009).</li><li>Samara, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+in+vivo+femtosecond+laser+neurosurgery+screen+reveals+small-molecule+enhancer+of+regeneration.">Large-scale in vivo femtosecond laser neurosurgery screen reveals small-molecule enhancer of regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2010).</li><li>Nelson, F. K., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+study+of+the+Caenorhabditis+elegans+secretory-excretory+system+using+laser+microsurgery.">Functional study of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system using laser microsurgery.</a> Journal of Experimental Zoology. 231, 45-56 (1984).</li><li>Sulston, J. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+cell+autonomy+during+postembryonic+development+of+Caenorhabditis+elegans.">Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 78, 577-597 (1980).</li><li>Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+cell+lineage+following+laser+ablation+of+cells+in+the+somatic+gonad+of+Caenorhabditis+elegans.">Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 87, 286-300 (1981).</li><li>Allen, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-synapse+ablation+and+long-term+imaging+in+live+C.+elegans.">Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173, 20-26 (2008).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Innate+Immune+Responses+to+Infection+and+Wounding+in+the+C.+elegans+Epidermis.">Distinct Innate Immune Responses to Infection and Wounding in the C. elegans Epidermis.</a> Current biology. CB 18, 481-489 (2008).</li></ol>

Çeşitli lazer sistemleri neurites C ile kesmek için kullanılır elegans ve birçok çalışmalar ayrıntılı 3,7,10,11 onların performansını inceledik. Protokolünde kullanılan MicroPoint lazer anahtar teslimi bir sistemi kurmak ve sürdürmek için kolay ve araştırmacılar için bir Ti-Safir lazer sistemi ile karşılaştırıldığında oldukça düşük bir maliyetle kullanılabilir. Ancak, Ti-Safir sistemi ile karşılaştırıldığında, bazı uygulamalar için dezavantaj olabilir daha geniş bir alana zarar vermek MicroPoint lazer bekleniyor. Ti-Safir sistemi istenirse, böyle bir sistem inşa mükemmel bir protokol 12 kullanılabilir. Geçerli protokol C. nöronların çeşitli yapılabilir elegans, ancak biz farklı türleri arasındaki nöronların rejeneratif kabiliyetleri farklılıklar 13 beklenen unutmayın. Ayrıca, farklı transgenik kökenden rejeneratif başarısını etkileyebilir. Yenileyici GABA nöron yüzdesi farklı transgenik marker suşları arasında oldukça tutarlı olmasına rağmen, biz oxIs12 15 solucanlar vs juIs76 14 rejenerasyon genel bir hafif bir artış kaydetti var. Dokunmatik nöronlar belirteçleri arasındaki farklar da 2 tarif edilmiştir. Boncuk, daha hızlı ve daha tutarlı immobilizasyon 16 sonuç olarak anestezikler daha ziyade mikro solucanlar hareketsiz tercih ediyor . Rejenerasyon anestezi 17 nedeniyle olası karıştırıcı etkileri, ücretsiz gözlemlemek mümkün olduğu gibi, bu da avantajlıdır . Immobilizasyon için alternatif bir anestezi gerektirmeyen yöntem mikroakışkan cihazların kullanımı. Axotomy için Mikroakiskan kullanımı yaygın 17-22 tarif edilmiştir. Biz her hafta MicroPoint kılavuzda belirtilen prosedürü izleyerek bir kez tutarlı kullanımı ile, en iyi Kumarin boya hücrede 440 lazer fonksiyonları değişmiş olduğunu bulabilirsiniz. Gerekirse, zayıflama sürgüsünü gücünü artırmak için kullanılır, ancak bu eski boya veya lazer hiza bir göstergesi olabilir. Ayrıca, boya hücre sınırlı bir ömrü vardır ve bir süre sonunda (Bkz Sorun Giderme) yeniden inşa edilecek veya değiştirilecek gerekecektir. Bu hayvan eksik felç olur, özellikle lazer odak işareti crosshair&#39;i altında hedef neurite manevra zor olabilir. Biz kesinlikle kullanışlı olmasına rağmen manuel bir aşamada, bu amaç için en uygun olduğunu bulabilirsiniz. Joystick kontrollü motorlu aşamasında daha hassas ve motorlu sahne taşımak için fare ile sürükleyerek görüntü destekleyen yazılım kullanarak en iyi olduğunu bulmak. Nikon Elements bu özelliği sağlar ve bu protokolü açıklanan, ancak ücretsiz micromanager paketi gibi diğer görüntüleme yazılımı, benzer işlevlere sahip olabilir. Ince hedefleme farklı bir şekilde hayvan yerine, lazer odağı taşımak için. Galvanometre ışın direksiyon mekanizması olarak kullanılabilir MicroPoint lazer add-on, bu yaklaşım tercih edilir. Nöronal rejenerasyon çalışması için uygulama yanı sıra, lazer ablasyon diğer hücre tipleri, cilt, kas, ya da özel hücreler gibi, ya da belirli nöron sinaps 23-27 bozmaya kullanılabilir . Ayrıca bu sistem ile, yaralanma ya da hastalık eşlik nöronların dejenerasyonu düzenleyen yollar araştırılmalıdır olabilir. Darbeli lazerler kullanmak gibi nöronal rejenerasyon ve diğer ilgili işlemleri kolaylaştırmak, genetik faktörler ve hücre biyolojik değişiklikler ışık tutmaya devam edecektir. Sorun Giderme: Bazı ortak sorunları ve bunlarla ilişkili çözümleri burada nitelendirdi. <ol type="a"><li> Lazer düzgün kesme değildir. Ya lazer odak dışında (bkz. Bölüm 2) Bunun nedeni, büyük olasılıkla, ya da boya hücreye boya değiştirilmesi gerekir (MicroPoint el kitabına bakın). Alternatif olarak, boya hücre değiştirilmesi veya yeniden inşa edilmesi gerekebilir. </li><li> Solucanlar agaroz pad üzerinde hareket ediyor. Bu genellikle agaroz pedi çok nemli olduğunu bir göstergesidir. Biz pedleri, solucanlar, bu sorunu aşmak için, üzerlerine yerleştirilen önce yaklaşık 30 saniye boyunca bırakılamayacak gerektiğini bulabilirsiniz. Ayrıca, daha küçük boyutlu (0.05 mikron) mikro kullanmayı deneyebilirsiniz. </li><li> Solucanlar kurtarma, zor ve verimsiz . Bu yanlış lamel kaldırma veya kuru bir agaroz ped neden olabilir. Pad çok kuru ise, aksonlar boncuklu görünüm geliştirmek olduğunu fark edebilirsiniz. Bazı durumlarda, solucanlar yakında sonra yapıldı pad üzerinde yer verilmemesi nedeniyle bu. Alternatif olarak, eski bir stok agaroz çözüm tekrarlanan erime sonra% 3 daha yüksek konsantrasyon olabilir. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> 0.05 mikron Polistiren Boncuk </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 08691 </td><td></td></tr><tr><td> 0.10 mikron Polistiren Boncuk </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 00876 </td><td></td></tr><tr><td> Agaroz GPG / LE </td><td> Biyoanalitik Amerikan </td><td> 00972 </td><td> Ultra saf </td></tr><tr><td> Falcon 14 ml Polistiren Yuvarlak Tabanlı Tüp </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> 17 x 100 mm tarzı, nonpyrogenic </td></tr><tr><td> Thermo Scientific Düz precleaned mikroskop slaytlar </td><td> Erie Bilimsel Şirketi </td><td> 420-004T </td><td> 3 &quot;x 1&quot; x 1 mm </td></tr><tr><td> Kapak Fiş </td><td> VWR </td><td> 48366 205 </td><td> 18 mm x 18 mm No 1 1 / 2 </td></tr><tr><td> KIMTECH Bilim Kimwipes </td><td> Kimberly-Clark </td><td> 34155 </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon 100 x 15mm Stil Petri Dish </td><td> BD Biosciences </td><td> 351029 </td><td></td></tr><tr><td> Teyp boş 3/4w x 500L </td><td> TimeMed </td><td> T-512 </td><td></td></tr><tr><td> Immersiyon </td><td> Nikon </td><td></td><td> A nd = 1.515 yazın </td></tr><tr><td> EG1285 veya CZ1200 </td><td> C. elegans Genetik Merkezi </td><td> http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/ </td><td></td></tr><tr><td> OptiScan II. </td><td> ÖNCE Bilimsel </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NIS-Elements Ar veya Br </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MicroPoint Ablasyon Lazer Sistemi </td><td> Bilimsel Fotonik </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bileşik mikroskop </td><td> Nikon </td><td> Eclipse 80i </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu Kamera </td><td> Photonics </td><td> Model C8484-05G01 </td><td></td></tr><tr><td> Intel Core 2 Duo işlemcili Dell Precision T3400 PC </td><td> Vadi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Windows XP Professional </td><td></td><td> Microsoft </td><td> Sürüm 2002, Seri Pack 3 </td></tr><tr><td> Çift kuru banyo İnkübatör </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Analog kontroller </td></tr><tr><td> 4X Planı Fluor objektif </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100X Planı Apo VC yağlı objektif </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 / 45 forseps </td><td> Dumont </td><td> 11251-35 </td><td> Dumoxel standart ipuçları # 7 de kullanabilirsiniz </td></tr><tr><td> Diseksiyon Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> SMZ800 </td><td> NI-150, Yüksek Yoğunluklu aydınlatıcısı ile </td></tr></tbody></table>

in vivo laser axotomy in c. elegans

Nöronlar akson ve dendritler üzerinden diğer hücrelere, ön ya da post-sinaptik uzmanlık içeren ince zarı uzantıları ile iletişim kurmak. Bir nöron, yaralanma ya da hastalık hasar görmüşse, yeniden olabilir. Hücre iç ve dış faktörleri fonksiyonunu yeniden ve yeniden bir nöronun yeteneğini etkiler. Son zamanlarda, nematod C. elegans genleri tanımlamak için mükemmel bir model organizma olarak ortaya çıkan ve nöronlar 1-6 rejenerasyon etkisi sinyal yolakları. C. nöronal rejenerasyon başlatmak için ana yol elegans, lazer aracılı kesim, ya da axotomy . Axotomy sırasında, bir floresan etiketli nöronal süreç, yüksek enerjili darbeler kullanarak kopmuş. Başlangıçta, C ile nöronal rejenerasyon elegans güçlendirilmiş bir femtosaniye lazer 5 kullanılarak incelenmiştir. Ancak, daha sonraki rejenerasyon çalışmaları pulsed lazer doğru in vivo nöronlar sever ve benzer bir rejeneratif cevap 1,3,7 ortaya çıkarmak için kullanılabileceğini göstermiştir. Biz MicroPoint darbeli lazer, hazır ve yaygın hedeflenen hücre ablasyon için kullanılan anahtar teslimi bir sistem kullanarak solucan in vivo lazer axotomy gerçekleştirmek için bir protokol mevcut. Biz, lazer hizalayarak, solucanlar montaj, özel nöronların kesim ve sonraki rejenerasyon değerlendirilmesi tarif. Sistem, bir deney sırasında birden fazla solucan nöron çok sayıda kesmek için yeteneği sağlar. Bu nedenle, burada açıklanan lazer axotomy yenilenme sürecini başlatmak ve analiz etmek için etkin bir sistem.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Laser Axotomy in C. elegans at JoVE.com

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Nöronların kesmek için bir protokol<em&gt; C. elegans</em&gt; MicroPoint darbeli lazer sunulmaktadır. Biz solucanlar hareketsizleştirir, sistem kurma ve etiketli nöronlar kesilmesinin tarif. Avantajları nispeten düşük maliyetli bir sistem ve nöronal süreçleri veya ablasyon hücreleri sever yeteneği<em&gt; In vivo</em&gt;.

C in vivo Lazer Axotomy elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

18.2K Görüntüleme.  Yale University School of Medicine. Nöronların kesmek için bir protokol C. elegans MicroPoint darbeli lazer sunulmaktadır. Biz solucanlar hareketsizleştirir, sistem kurma ve etiketli nöronlar kesilmesinin tarif. Avantajları nispeten düşük maliyetli bir sistem ve nöronal süreçleri veya ablasyon hücreleri sever yeteneği In vivo.

Video: In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Nörobilim

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Içinde Synaptic florasan Otomatik Sayısallaştırma<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Takip ve Davranış Ölçme

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Uzun vadeli Olfaktör İntibak A Moleküler Saati<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Sırasında Neuroblast Sitokinez görselleştirme<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyo

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Serebellar Aksonlar Lazer Nanosurgery<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

C. Dauer-spesifik nöronal Yaptırma Vivo Görüntülemede elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...