La caratterizzazione del modello 3D in vitro a risoluzione cellulare e subcellulare è fondamentale per il pieno sfruttamento, ma può essere impegnativa. Pertanto, abbiamo fornito un protocollo complementare per la colorazione e l'imaging con risoluzione subcellulare di modelli 3D fissi in vitro che vanno da 100 micrometri a diversi millimetri. Le strutture 3D sono radiali e devono essere attentamente manipolate.
Prima di pipettare, controllare la posizione delle strutture 3D all'interno del tubo per evitare qualsiasi aspirazione. Poiché abbiamo adattato le tecniche classiche per l'incorporazione di piccole strutture come organoidi o sferoidi, le istruzioni visualizzate possono aiutare gli utenti alle prime armi a eseguire l'attività più facilmente. A dimostrare la procedura con me sarà Laura Francols, un tecnico di laboratorio della Pathology Research Platform.
Per preparare i campioni per la colorazione 3D a montaggio intero, utilizzare una punta per pipetta da un millilitro precodificata con BSA per aggiungere una sospensione strutturale 3D da un millilitro a un tubo da 500 microlitri di PBS. Quando le strutture 3D si sono depositate sul fondo del tubo, sostituire con cura il PBS con 500 microlitri di soluzione di blocco della permeabilizzazione per un'ora di incubazione a temperatura ambiente con delicata agitazione orizzontale a 30-50 giri al minuto. Alla fine dell'incubazione, lasciare che le strutture 3D sedimentino di nuovo prima di lavare accuratamente le strutture 3D due volte in un millilitro di 0,1% PBS integrato con BSA per tre minuti per lavaggio.
Dopo l'ultimo lavaggio, etichettare le strutture 3D con 250 microlitri di anticorpi primari in PBS per due o tre giorni con delicata agitazione orizzontale a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, lavare il campione con cinque lavaggi da tre minuti e due da 15 minuti in un millilitro di BSA allo 0,1% di PBS per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, etichettare le strutture 3D con 250 microlitri dell'anticorpo secondario appropriato in PBS per 24 ore a quattro gradi Celsius con delicata agitazione orizzontale protetta dalla luce.
Il giorno successivo, etichettare le strutture 3D con 250 microlitri della concentrazione appropriata di Hoechst 3342 per un'incubazione di due ore a quattro gradi Celsius con delicata agitazione orizzontale. Alla fine dell'incubazione, lavare le strutture 3D cinque volte per tre minuti e due volte per 15 minuti in un millilitro di PBS per lavaggio come dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire le strutture 3D su una micropiastra di polistirene nero a 96 pozzetti e aggiungere delicatamente 200 microlitri di soluzione trasparente sulle strutture, evitando bolle.
Quindi posizionare la piastra coperta con un foglio di alluminio a quattro gradi Celsius per almeno 48 ore. Per incorporare modelli di colture cellulari 3D di grandi dimensioni, utilizzare una punta di pipetta da un millilitro rivestita BSA per trasferire con cura le strutture 3D su un tubo di vetro a fondo piatto con un tappo di bottiglia rivestito in PTFE. Dopo che le strutture si sono sistemate, sostituire accuratamente il PBS con etanolo al 70% per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, sostituire l'etanolo al 70% con un millilitro di soluzione di eosina Y pronta all'uso. Sfiorare il tubo e macchiare le strutture per almeno 30 minuti. Al termine dell'incubazione, disidratare le strutture con tre lavaggi successivi di 30 minuti in un millilitro di etanolo al 100% per lavaggio.
Dopo l'ultima disidratazione, pulire le strutture 3D con tre lavaggi successivi di 30 minuti in un millilitro di xilene per lavaggio sotto una cappa chimica. Dopo l'ultima immersione nello xilene, posizionare un pezzo di tampone per biopsia imbevuto di xilene in uno scomparto di una cassetta di tessuto microgemello bianco e utilizzare una pipetta Pasteur in plastica da due millilitri rivestita BSA per trasferire le strutture 3D sul pad. Coprire le strutture 3D con un altro tampone per biopsia imbevuto di xilene per tenere le strutture 3D in posizione e chiudere la cassetta.
Quando tutti i campioni sono stati trasferiti, posizionare le cassette in un bagno di paraffina a 65 gradi Celsius per 30 minuti prima di posizionare le cassette in un bagno di paraffina fresco a 65 gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, aggiungere la paraffina liquida a uno stampo di incorporazione riscaldato a 65 gradi Celsius per campione e posizionare un campione incorporato di paraffina in ogni stampo. Agitare delicatamente gli stampi fino a quando tutte le strutture 3D cadono sul fondo e utilizzare una pinza fine riscaldata a 65 gradi Celsius per posizionare le strutture 3D al centro di ogni stampo.
Raffreddare lo stampo fino a quando la paraffina forma un sottile strato solido, fissando la struttura 3D in posizione. Posizionare una cassetta di carta e aggiungere la paraffina calda sullo stampo. Rimuovere lo stampo quando la paraffina si è completamente solidificata.
Per incorporare piccoli modelli di coltura cellulare 3D, lavare delicatamente le strutture 3D tre volte in un millilitro di TBS per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere quanto più TBS possibile senza toccare le strutture e aggiungere due gocce di reagente due da un kit di incorporamento di paraffina commerciale. Mescolare delicatamente picchiettando e aggiungere due gocce di reagente una con picchiettamento fino a quando il gel si solidifica.
Utilizzare una pinza fine per trasferire il gel dal pozzetto della cassetta preassemblata dal kit e disidratare il campione incorporato nel gel con incubazioni ascendenti di etanolo e xilene di 30 minuti in una cappa aspirante come indicato. Dopo l'ultima immersione nello xilene, posizionare la cassetta in un bagno di paraffina a 65 gradi Celsius durante la notte prima di utilizzare una pinza fine per trasferire il campione incorporato in paraffina al centro di uno stampo di incorporamento riscaldato a 65 gradi Celsius caricato con paraffina liquida. Quindi fissare la struttura 3D con un altro strato di paraffina, come dimostrato per i modelli di coltura cellulare 3D di grandi dimensioni.
La colorazione tridimensionale a montaggio intero e la microscopia confocale forniscono informazioni visive sulla composizione cellulare e sulla posizione spaziale dei modelli di coltura 3D a un campo di profondità fino a 200 micron. L'alta risoluzione che si può ottenere per le strutture 3D utilizzando questo protocollo consente l'applicazione di algoritmi di segmentazione cellulare e subcellulare per la quantificazione del numero di cellule e la rilevazione di vari marcatori cellulari all'interno di diversi sottotipi cellulari. L'analisi 3D di supporti interi può essere applicata a celle visualizzate fino a 200 micron di profondità, indipendentemente dall'intera struttura.
Al contrario, l'analisi delle sezioni 2D può fornire informazioni su celle di qualsiasi dimensione.
