Questo metodo consente di coltivare tre diverse specie di batteri magnetotattici chiamati MSR-1, AMB-1 e MS-1. Tutte le specie d'acqua dolce, e tutte del genere magnetospirillum. Si tratta di un primo passo essenziale per qualsiasi tipo di ricerca riproducibile che coinvolga questi organismi.
I batteri magnetotattici hanno requisiti di ossigeno molto specifici, motivo per cui hanno sviluppato un sistema di navigazione magnetica. È quindi molto importante controllare la quantità di ossigeno a loro disposizione. Tutto questo protocollo è stato ottimizzato per alcuni ceppi specifici di magnetospirilla d'acqua dolce.
I suoi dettagli possono essere ottimizzati al fine di soddisfare il fabbisogno di ossigeno e nutrienti di altri batteri magnetotattici. Installare in sicurezza un serbatoio di gas azoto vicino a un banco su cui c'è abbastanza spazio per allevare la stazione di azoto. Collegare un pezzo di tubo al serbatoio che è abbastanza lungo da raggiungere l'area in cui verrà costruita la stazione.
Se necessario, applicare il nastro teflon all'uscita del serbatoio per evitare perdite. Per costruire una stazione in grado di gorgogliare cinque bottiglie di mezzo contemporaneamente, tagliare quattro pezzi di tubi di circa cinque centimetri di lunghezza. Assemblare i pezzi di tubi in linea con tre raccordi in plastica a forma di T a 3 modi.
Collegare un'estremità di questa linea al pezzo di tubo all'uscita del serbatoio dell'azoto attraverso un raccordo extra a forma di T. Aggiungere un raccordo a gomito di 90 gradi all'altra estremità. Utilizzare il nastro adesivo per fissare la struttura a un'asta metallica orizzontale posizionata a circa 30 centimetri sopra la panca.
Collegare cinque pezzi di tubi di circa 20 centimetri di lunghezza alle tre uscite dei raccordi installati. Rimuovere i pistoni da cinque siringhe di plastica da un millilitro e tagliare l'estremità più grande di queste siringhe, mantenendo solo la parte graduata. Riempire queste siringhe con cotone, facendo attenzione a non fare le valigie troppo strettamente.
Inserire le siringhe nei pezzi verticali di tubi lunghi 20 centimetri. Accendere il gas e utilizzare acqua sapona per assicurarsi che non vi siano perdite quando l'azoto scorre. Rimuovere i tappi di cinque aghi calibro 25 e inserire questi aghi in pezzi di 10 centimetri di tubi sottili.
Attaccare gli aghi preparati alle siringhe della stazione di azoto. Assicurarsi che l'azoto fluisa attraverso tutte e cinque le linee e mantenere la stazione in standby. Preparare una soluzione di citrato ferrico da 10 millimolare aggiungendo 0,245 grammi di citrato ferrico a 100 millilitri di acqua deionizzata distillata.
Scaldare e mescolare per sciogliere fino a ottenere una soluzione chiara arancione. Autoclavare la soluzione utilizzando un ciclo standard di almeno 15 minuti di esposizione a 121 gradi Celsius prima di conservare la soluzione di stock sterilizzato a temperatura ambiente al buio. Per preparare cinque bottiglie di mezzo di crescita liquida per MSR-1, aggiungere le sostanze chimiche elencate in un protocollo di testo a un bicchiere contenente 300 millilitri di acqua deionizzata distillata.
L'aggiunta del citrato ferrico sterile e delle soluzioni minerali deve essere eseguita sotto la fiamma di un bruciatore Bunsen utilizzando tecniche steril. Le condizioni sterili sono essenziali per evitare la contaminazione della coltura da parte di altre specie batteriche. Dopo l'aggiunta di tutte le sostanze chimiche, regolare il pH a 7.0 con una soluzione molare di idrossido di sodio.
Distribuire il mezzo appena preparato in bottiglie di siero da 125 millilitri, versando 60 millilitri di mezzo in ogni bottiglia. Bollare l'azoto nel mezzo per 30 minuti per rimuovere l'ossigeno disciolto utilizzando i piccoli tubi collegati alla stazione di azoto. Posizionare un tappo di gomma butile sopra ogni bottiglia, lasciando una piccola apertura per consentire al gas in eccesso di uscire dalla bottiglia.
Dopo 30 minuti, crimpare ogni bottiglia con il tappo preparato e una guarnizione in alluminio. La guarnizione in alluminio assicura che la bottiglia rimanga sigillata durante il resto del protocollo. Scollegare gli aghi e i tubi sottili dalla stazione di azoto e sostituirli con aghi puliti.
Regolare le valvole del serbatoio dell'azoto in modo che un flusso delicato e continuo di gas esca dal serbatoio. Ora, inserire uno degli aghi collegati al serbatoio dell'azoto in una bottiglia di mezzo attraverso il tappo di gomma. Inserire immediatamente un altro ago pulito nella stessa bottiglia.
Ripetere questo passaggio per le altre bottiglie e lasciare scorrere l'azoto per circa 30 minuti per sostituire l'aria nelle bottiglie con azoto. Dopo 30 minuti, scollegare una bottiglia dalla stazione di azoto rimuovendo l'ago corrispondente. Attendere alcuni secondi fino a quando la pressione nella bottiglia di mezzo diminuisce alla pressione atmosferica e rimuovere il secondo ago.
Ripetere questo passaggio per tutte le bottiglie rimanenti. Per preparare 120 millilitri di mezzo di crescita semisolido per MSR-1, coprire il becher con foglio di alluminio e autoclave la soluzione preparata come descritto nel protocollo di testo. Poco prima della fine del ciclo dell'autoclave, preparare una nuova soluzione di cisteina al 4% e regolare il pH a 7,0 con una soluzione di idrossido di sodio molare, come descritto nel protocollo di testo.
Dopo l'autoclave, lasciare raffreddare il mezzo fino a 50-60 gradi Celsius e portare il becher sotto la fiamma di un bruciatore Bunsen. Rimuovere il foglio di alluminio e aggiungere rapidamente le sostanze chimiche elencate nel protocollo di testo utilizzando tecniche sterili mescolando delicatamente. Aggiungere 1,2 millilitri di soluzione di cisteina sterilizzata a filtro.
Dopo l'aggiunta di tutte le sostanze chimiche, trasferire il mezzo caldo in 16 millilitri tappo a vite sterile Tubi Hungate. Trasferire 12 millilitri del mezzo in ogni tubo e sigillare i tubi. Per inoculare i ceppi MSR-1, AMB-1 e MS-1 in mezzo liquido, fiammare le cime dell'ossigeno e delle bottiglie medie fresche applicando etanolo sui tappi e passandoli attraverso la fiamma di un bruciatore Bunsen.
Utilizzando una siringa sterile e un ago, estrarre un millilitro di ossigeno dalla bottiglia di ossigeno e trasferirlo nella bottiglia media fresca. Se si utilizza l'inoculo di un'altra coltura coltivata in una bottiglia di vetro, fiammare entrambe le bottiglie. Quindi inoculare un millilitro della coltura più antica nel mezzo fresco.
Incubare la coltura a 32 gradi Celsius e inocularla in mezzo fresco dopo quattro o sette giorni. Per inoculare MSR-1 in gradiente di ossigeno, mezzo semisolido, verificare che il tubo di mezzo fresco mostra un OAI ben definito, materializzato da un'interfaccia da rosa a incolore circa uno o tre centimetri sotto la superficie del mezzo. Se l'inoculo proviene da un'altra coltura semisolida del gradiente di concentrazione di ossigeno, raccogliere i batteri aspirando 50 microlitri della coltura con una punta sterile di pipetta posta sulla banda formata dai batteri.
Inoculare lentamente questi batteri all'OAI nel mezzo fresco, evitando di disturbare l'interfaccia. Sigillare il tubo e lasciare che i batteri crescano tra i 25 gradi Celsius e i 30 gradi Celsius. Per assicurarsi che i batteri siano sia magnetici che modali, posizionare una goccia di coltura sullo scivolo di copertura del microscopio.
Capovolgere il coperchio e installarlo su un O-ring appoggiato su uno scivolo di vetro. Assicurarsi che la caduta non tocchi la diapositiva inferiore. Posizionare la goccia appesa al microscopio e concentrarsi su un bordo della goccia.
Posizionare il polo sud di un magnete vicino a quel bordo e guardare i batteri nuotare verso il bordo. Capovolgere il magnete per farli nuotare nella direzione opposta. Qui sono mostrate le bottiglie di mezzi liquidi prima dell'inoculazione e dopo la crescita batterica.
La torbidità nella seconda bottiglia indica che i batteri stanno crescendo. Questo film due volte accelerato mostra il risultato atteso di un esperimento di caduta sospesa per una coltura di batteri magnetotattici modali e magnetici. I batteri inizialmente nuotavano verso il bordo della goccia quando viene applicato un campo magnetico.
Quando la direzione del campo del magnete è invertita, i batteri nuotano lontano dal bordo in cui viene applicato il campo magnetico. Qui sono mostrati tubi di mezzo semisolido prima dell'inoculazione e dopo la crescita batterica. Come previsto, una banda di batteri si forma all'interfaccia osso-anossica e migra nel tempo man mano che l'ossigeno viene consumato e l'interfaccia si sposta verso l'alto.
Qui è mostrata una micrografia elettronica rappresentativa di uno spirillo magnetico. Le flagelli sono indicate dalle frecce nere, mentre le frecce rosse mostrano i magnetosomi. Quando si tenta questa procedura, è molto importante ricordare che i batteri magnetotattici hanno requisiti di livello di ossigeno molto specifici per crescere correttamente e produrre magnetosoma.
Questo protocollo mostra come controllare e monitorare i livelli di ossigeno nei mezzi di crescita al fine di raggiungere le micro condizioni preferite da questi organismi. Seguendo questo metodo, è possibile ottenere alte concentrazioni di cellule sane e altamente magnetiche. In questo modo, possono essere eseguiti esperimenti che richiedono grandi quantità di batteri, come l'estrazione di magnetosomi, studi genomici e genetici o l'osservazione del moto collettivo mediante microscopia.
La possibilità di coltivare batteri magnetotattici in laboratorio è davvero ciò che ha permesso agli scienziati di esplorare in modo sistematico le affascinanti proprietà biochimiche e fisiche di questi organismi.
