Il metodo che stiamo usando qui può aiutare a confezionare oligonucleotide con nanotubo di carbonio a parete singola, che è un nuovo tipo di nanoparticella per la somministrazione di farmaci. Il principale vantaggio di questa tecnica è la somministrazione più efficiente di farmaci oligonucleotidi nelle cellule in vivo. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla ricerca del mieloma multiplo, perché ha introdotto la nanoparticella per migliorare la consegna dei farmaci oligonucleotidi.
Attraverso questo metodo può fornire informazioni sul trattamento per mieloma multiplo. Può anche essere applicato ad altre malattie e coniugato con altri carichi, come proteine e piccole molecole. In primo luogo, mescolare un milligrammo di nanotubi di carbonio a parete singola, cinque milligrammi di ammina DSPE-PEG 2000 e cinque millilitri di acqua sterilizzata priva di nucleasi in una fiala a scintillazione di vetro da 20 millilitri.
Sonicare il flaconcino in un sonicatore a bagno d'acqua a un livello di potenza di 90 watt per un'ora a temperatura ambiente. Dopo la sonicazione, centrifugare il flaconcino a 24.000 volte g per sei ore. Quindi raccogliere la soluzione supernatante.
Aggiungere un millilitro della soluzione di nanotubo di carbonio a parete singola a un dispositivo di filtro centrifugo cutoff a peso molecolare da 100 kilodalton seguito da quattro millilitri di acqua sterilizzata priva di nucleasi. Centrifugare per 10 minuti a 4.000 volte g a temperatura ambiente per rimuovere l'ammina in eccesso. Aggiungere 0,5 milligrammi di Sulfo-LC-SPDP a 450 microlitri del nanotubo di carbonio a parete singola funzionalizzato all'ammina.
Quindi aggiungere 50 microlitri di 10x PBS e incubare per due ore a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere la miscela di reazione a un dispositivo di filtro centrifugo tagliato a peso molecolare da 100 kilodalton, seguito da quattro millilitri di acqua priva di nucleasi. Centrifugare il campione per 10 minuti a 4.000 volte g a temperatura ambiente per rimuovere l'eccesso di Sulfo-LC-SPDP.
Raccogliere la soluzione di nanotubo di carbonio a parete singola trattata Con Sulfo-LC-SPDP lasciata nel filtro e diluirla con 500 microlitri di soluzione anti-MALAT1-Cy3 precedentemente preparata. Quindi incubare il campione a quattro gradi Celsius durante la notte. Per ottenere i migliori risultati del confronto, organizzare casualmente 14 topi in gruppi di prova o di controllo con sette in ogni gruppo e con lo stesso rapporto maschio-femmina in ogni gruppo.
Quindi, pulire il banco operativo e sterilizzarlo con alcool etilico al 70%. Usa una lampada riscaldante per riscaldare uno dei topi per aiutare la vena della coda ad apparire. Trattenere correttamente il mouse con un limitatore di iniezione della coda.
Iniettare cellule MM.1S-luc/mCherry in 50 microlitri di PBS attraverso la vena della coda. Premere il sito di iniezione con un tampone alcolico per 30 secondi. Quindi contrassegnare il topo iniettato e restituirlo in una gabbia pulita.
Il settimo giorno, dopo l'iniezione cellulare MM1S, iniettare 50 microlitri di PBS contenenti nanotubo di carbonio a parete singola anti-MALAT1 nella vena di coda del topo. Quindi premere il sito di iniezione con un tampone alcolico per 30 secondi. Osservare il sanguinamento locale sulla coda e il comportamento generale del topo per un minuto, quindi restituirlo in una gabbia pulita.
Osservare nuovamente tutti i topi iniettati prima di riportare la gabbia al rack per assicurarsi che le iniezioni siano tollerate bene. Pesare ogni mouse prima della dissezione. Raccogliere il sangue periferico dal cuore per un test completo dell'emotere eseguito da una macchina per il contatore delle cellule del sangue.
Successivamente, raccogliere i tessuti del midollo osseo, della milza, del linfonodo, del rene e del tessuto con metastasi visibile. Estrarre RNA e proteine dai campioni di midollo osseo. Fissare tutti i tessuti rimanenti in formalina.
Dopo 24 ore di fissazione, immergere i campioni ossei in una soluzione EDTA 0,5 molare per cinque giorni per la decalcificazione. Quindi immergere tutti i campioni in alcol etilico al 75% per la conservazione a lungo termine. I risultati della QRT PCR hanno mostrato che il DNA gapmeR anti-MALAT1 ha abbattuto l'espressione MALAT1 e ha indotto l'apoptosi in modo significativo nelle cellule H929 e MM.1S.
Il nanotubo di carbonio a parete singola anti-MALAT1-Cy3 è stato consegnato nel nucleo delle cellule MM e ha soppresso significativamente il livello endogeno di MALAT1 sia nelle cellule H929 che MM.1S. La vitalità della cellula BMEC-1 non ha alcuna differenza significativa dopo il trattamento del nanotubo di carbonio a parete singola anti-MALAT1-Cy3 o il controllo a diversi dosaggi e timepoint. Ciò indica che la tossicità del nanotubo di carbonio a parete singola anti-MALAT1-Cy3 ha una tossicità limitata e accettabile per le cellule normali ad alto dosaggio.
È stato istituito un modello di topo umano diffuso in MM per valutare gli effetti di trattamento del nanotubo di carbonio a parete singola anti-MALAT1 in vivo. I segnali di luciferone dei topi nel gruppo di trattamento anti-MALAT1 a nanotubo di carbonio a parete singola erano notevolmente inferiori rispetto al controllo dopo 21 giorni di trattamento. Da questi risultati, si è concluso che il trattamento anti-MALAT1 a nanotubo di carbonio a parete singola tramite iniezione endovenosa poteva fornire efficacemente gli oligo anti-MALAT1 alle cellule tumorali.
Non sono stati osservati effetti collaterali significativi del trattamento, indicando che l'iniezione anti-MALAT1 di nanotubo di carbonio a parete singola è un trattamento sicuro per i topi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la composizione della molecola cellulare influenzerà il parto, l'efficienza e l'effetto terapeutico dei farmaci oligonucleotidi. Seguendo questa procedura, altri metodi come la coniugazione di proteine o piccole molecole possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive.
Come usare nanotubi di carbonio a parete singola per fornire altri farmaci.
