Questo protocollo microscopico confocale permetterà l'interpretazione del comportamento ecologico e degli adattamenti delle microalghe da ambienti estremi con crescita lenta in laboratorio utilizzando l'autofluorescenza dei loro pigmenti. Questa tecnica non è invasiva e riduce al minimo gli artefatti in quanto non vengono utilizzati composti chimici. Conoscere le prestazioni dei pigmenti degli autotrofi e la corrispondente crescita permetterà la progettazione dei metodi di controllo che è il più grande interesse per le grotte turistiche e i monumenti architettonici.
Iniziare a preparare l'inoculo di Chroothece mobilis trasferendolo dalla coltura di agar al mezzo di acqua di mare o al mezzo liquido SWES. Mantenere tutte le colture per due settimane con un periodo di foto scure da 16 a 8 a 20 gradi Celsius sotto una bassa intensità di luce bianca e senza agitare fino ad ottenere la densità cellulare desiderata. Utilizzare un millilitro della coltura di fase esponenziale con cinque volte 10 alla terza cella per millilitro di densità cellulare da inoculare in una piastra a 24 pozzetti per diversi esperimenti.
Per riprodurre l'effetto di luce monocromatica, utilizzare il filtro verde che consente alla luce verde di passare da 470 a 570 nanometri con un picco alla lunghezza d'onda di 506 nanometri e alla luce rossa regolata utilizzando un filtro tra 590 e 720 nanometri e picchi a 678 nanometri. Esporre le colture cellulari a questa luce per due settimane. Accendere tutti i componenti del microscopio a scansione laser confocale invertito, incluso il laser.
Montare le celle nel mezzo di crescita SWES da ciascun pozzetto sperimentale della piastra a 24 pozzetti su un piatto di vetro da 35 millimetri per l'imaging. Scegli l'obiettivo ad immersione numerica 63X o 1,30 o NA glicerolo e posiziona il glicerolo sull'obiettivo. Quindi, posizionare la piastra del pozzetto sul palco del microscopio assicurandosi che il campione non si muova durante l'acquisizione dell'immagine.
Centrare il campione nel percorso della luce e concentrarsi sul centro della cella selezionando il piano con la più alta intensità di fluorescenza. Una volta fatto, apri il software di acquisizione delle immagini e scegli XY lambda dall'elenco a discesa nella modalità di acquisizione. Selezionare la linea di eccitazione del laser 561 nanometri, otto bit di gamma dinamica e 1024 per 1024 pixel.
Raccogli gli spettri di emissione di fluorescenza nella larghezza di banda di 10 nanometri e la dimensione del passo lambda di quattro nanometri nell'intervallo da 570 a 760 nanometri. Impostare il foro stenopeico su un'unità d'aria ed eseguire l'acquisizione della scansione lambda. Dopo aver ripetuto questo processo in diversi campi visivi e nelle diverse condizioni di luci rosse e verdi, salvare tutti i dati.
Una volta acquisita la scansione lambda, fare clic sulla finestra di quantificazione nella parte superiore del software per valutare gli spettri di emissione di fluorescenza raccolti. Vai alla finestra aperta del progetto e seleziona un file lambda XY. Selezionare l'analisi del profilo impilato nel software di imaging e definire una regione di interesse di quattro micrometri quadrati al centro di una cella per analizzare l'intensità media della fluorescenza.
Esporta i dati e il CSV prima di ripetere il processo con celle diverse in condizioni diverse. Successivamente, aprire i file CSV per selezionare i diversi picchi di emissione di fluorescenza di tutte le regioni di interesse misurate selezionando i dati di massima fluorescenza di ficoeritrina ficocianina, C.phycocyanin, allophycocyanin e clorofilla A rispettivamente nel file CSV. Una volta fatto, creare una nuova tabella con tutti i valori massimi di fluorescenza ottenuti da ciascun picco di ficobiliproteine e clorofilla e tracciare i dati su un grafico.
Sono state osservate differenze significative nell'intensità media della fluorescenza. L'intensità media di fluorescenza della ficoeritrina ficocianobilina è diminuita significativamente quando le cellule sono state esposte a luce verde monocromatica. Al contrario, non è stata osservata alcuna differenza nella luce rossa rispetto al controllo.
La luce verde ha avuto l'effetto opposto sull'alloficocianina e sulla clorofilla A in cui l'intensità media della fluorescenza è aumentata significativamente a causa dell'adattamento dei complessi di antenne a causa dell'aumento della quantità o della migliore connettività dei complessi di antenne, tra gli altri. La luce rossa ha prodotto un aumento non significativo della fluorescenza dell'alloficocianina e della clorofilla. Per studiare l'effetto delle diverse condizioni di crescita sulle cellule in coltura, è fondamentale eseguire le misurazioni esattamente con le stesse impostazioni del microscopio.
E' possibile analizzare altri parametri ambientali rilevanti per la coltura di organismi di autofluorescenza, nonché il segnale di fluorescenza all'interno dello spettro visibile. Questa tecnica è un approccio molto potente per studiare organismi viventi con diversi pigmenti di autofluorescenza.
