Questo protocollo può essere utilizzato e ulteriormente sviluppato per analizzare come le radiazioni ionizzanti influenzano il reclutamento delle cellule tumorali, portando a una maggiore comprensione della recidiva del cancro. Gli organoidi mammari sono modelli potenti. Imitano le caratteristiche in vivo di base, ma consentono un facile isolamento delle variabili biologiche.
L'uso di piastre a bassa adesione nega le sfide del flusso di lavoro associate alle matrici proteiche. I pazienti con tumore al seno triplo negativo sperimentano recidiva regionale locale a tassi più elevati dopo la terapia. Studiare come le radiazioni influenzano il comportamento del tumore e delle cellule immunitarie porterà a importanti intuizioni sui meccanismi di ricorrenza.
A dimostrare la microscopia confocale degli organoidi è Javier Gomez, uno studente laureato nel laboratorio silvera batista. Inizia questa procedura con la rimozione delle ghiandole mammarie addominali e inguinali dai topi sacrificati come descritto nel protocollo di testo. 45 minuti dopo l'irradiazione dei campioni come descritto nel protocollo di testo, posizionare le ghiandole mammarie in una piastra cellulare sterile di 35 millimetri e tritare con bisturi.
Tritare con circa 40 colpi fino a quando il tessuto si rilassa e si ottengono pezzi che non sono più grandi di circa un millimetro quadrato di area. Ora trasferisci il tessuto in soluzione di collagenasi in un tubo di centrifuga da 50 millilitri. Utilizzare 10 millilitri di soluzione di collagenasi per topo.
Posizionare i tubi campione in un bagno d'acqua per 30-60 minuti a 37 gradi Celsius, vortice per cinque secondi ogni 10 minuti. La digestione è completa quando la soluzione di collagenasi è torbosa. Far girare la soluzione digerita a 450 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente.
Ora si osservano tre strati. Il supernatante è composto da grasso, lo strato intermedio è una soluzione acquosa e il fondo è un pellet. Il pellet appare rosso, in quanto è una miscela di cellule epiteliali, singoli globuli stromali e globuli rossi.
Pre-rivestire tutte le pipette, le punte delle pipette e i tubi di centrifuga con soluzione BSA prima del contatto mediante aggiunta e rimozione della soluzione BSA. La soluzione BSA può essere riutilizzata, anche se deve essere filtrata sterilemente prima di ogni esperimento. Per un ulteriore recupero, trasferire il supernatante in un tubo fresco da 15 millilitri rivestito di BSA.
Pipetta su e giù vigorosamente per disperdere lo strato di grasso. Centrifugare il campione a 450 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante, lasciando una piccola quantità di supporto nel tubo per evitare di aspirare il pellet cellulare.
Ora aspira lo strato acquoso dal tubo con il pellet originale. Aggiungere 10 millilitri di DMEM/F12 al tubo con il pellet originale e trasferirli al secondo tubo. Pipetta vigorosamente per combinare e rimescolare i due pellet.
Dopo aver centrifugato a 450 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente, aspirare il supernatante e aggiungere quattro millilitri di DMEM/F12 al tubo. Aggiungere 40 microlitri di deossiribonucleasi alla sospensione e agitare delicatamente a mano per due o cinque minuti a temperatura ambiente. Aggiungere accuratamente sei millilitri di DMEM/F12 e pipetta.
Dopo aver centrifugato il tubo a 450 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente, aspirare il supernatante al segno di 0,5 millilitri. Resuspend il pellet in 10 millilitri di DMEM/F12 e pipetta accuratamente. Ora centrifuga il tubo pulsando a 450 volte G e fermandosi quattro secondi dopo aver raggiunto quella velocità.
Ripetere i passaggi di lavaggio altre tre volte per purificare gli organoidi tramite differenziazione centrifuga. Il pellet dovrebbe ora essere un colore bianco sconto costituito solo da organoidi epiteliali. Resuspend il pellet in 10 millilitri di DMEM/F12.
Pipetta accuratamente per creare una soluzione omogenea. Trasferire 50 microlitri in una piastra di Petri da 30 millimetri e visualizzarli al microscopio a contrasto di fase a 20X. Contare il numero di organoidi con un contatore tally.
Pipetta 50 microlitri di organoidi in ogni pozzo di una piastra a bassa adesione. Aggiungere 150 microlitri di mezzo organoide per portare il volume di lavoro totale a 200 microlitri. Sostituire con cura il mezzo ogni due giorni.
Mantenere i macrofagi grezzi con etichetta GFP o D 264,7 in supporti DMEM integrati con 10%FPS e 1%penicillina-streptomicina. Seminare le cellule nel mezzo organoide alla densità desiderata. Usa il contrasto di fase delle cellule vive e l'imaging fluorescente per monitorare l'infiltrazione di macrofagi nel tempo.
Rimuovere il mezzo organoide dai pozzi aspirando con cura. Fissare i campioni con formalina tamponata al 10% in modo neutro per 15 minuti a temperatura ambiente. Lavare gli organoidi fissi tre volte per cinque minuti in 1X PBS.
Se lo si desidera, i campioni fissi possono essere conservati a quattro gradi Celsius per una settimana per un'ulteriore colorazione. Dopo il lavaggio, permeabilizzare gli organoidi fissi per cinque minuti. Bloccare gli organoidi fissi con siero di capra normale al 5% nello 0,1%PBST per un'ora a temperatura ambiente prima di lavarsi tre volte per cinque minuti con PBS.
Incubare gli organoidi fissi con anti-citocheratina-14, E-cadherina o proteina a giunzione stretta uno, in 1%NGS in PBST per un'ora a temperatura ambiente. Quindi lavare tre volte per cinque minuti in PBST. Ora incuba gli organoidi con anticorpi secondari anti-coniglio di capra con 1%NGS PBST per un'ora a temperatura ambiente.
Coprire con un foglio per evitare l'esposizione alla luce. Dopo il lavaggio come prima, utilizzare il colorante nucleare per macchiare i nuclei per circa mezz'ora. Lavare gli organoidi macchiati per cinque minuti in PBS tre volte.
Se si utilizza uno scivolo a camera, montare con uno slittamento di copertura. Conservare gli organoidi avvolti in un foglio a quattro gradi Celsius per un massimo di due settimane. Gli organoidi irradiati potevano essere coltivati in piastre a bassa adesione, o all'interno della membrana basale, ma la crescita più rapida si è verificata nelle piastre a bassa adesione.
Gli organoidi ricapitolavano le caratteristiche della ghiandola mammaria. Sono stati osservati costrutti morfologicamente simili a dotti e lobi. Le tendenze di crescita hanno indicato che quando gli organoidi sono stati immediatamente seminati dopo la digestione e lo smistamento, gli organoidi non irradiati sono cresciuti più velocemente degli organoidi irradiati, molto probabilmente a causa dell'arresto della crescita cellulare derivante da meccanismi di riparazione dei danni al DNA.
Gli organoidi esprimevano caratteristiche epiteliali, che venivano valutate attraverso la colorazione immunofluorescente. Gli organoidi irradiati hanno espresso marcatori epiteliali. La citocheratina-14, un marcatore di mioepitelio, è stata espressa fortemente sulla superficie degli organoidi irradiati.
Inoltre, l'E-cadherina e la proteina a giunzione stretta sono state espresse all'interno delle giunzioni cellulari degli organoidi. Queste proteine sono essenziali per una corretta adesione cellulare. Dopo l'irradiazione, gli organoidi hanno continuato a mantenere le loro caratteristiche epiteliali.
La colorazione fluorescente degli organoidi potrebbe essere vista all'interno di piastre a bassa adesione utilizzando la microscopia a fluorescenza. Tuttavia, la visualizzazione più chiara è stata ottenuta tramite microscopia confocale. L'intensità di fluorescenza totale corretta è stata calcolata sottraendo lo sfondo e normalizzando per area organoide.
La crescita degli organoidi nelle placche a bassa adesione da 96 pozzi ha anche semplificato gli esperimenti di co-coltura. Se sementi a concentrazioni tipiche della ghiandola mammaria, la colocalizzazione dei macrofagi è aumentata con organoidi irradiati. Quando si esegue questa procedura, le cose più importanti da ricordare sono non digerire eccessivamente gli organoidi e purificare adeguatamente la differenziazione centrifuga.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire ulteriori esperimenti di co-coltura. Gli organoidi possono essere co-coltivati con cellule tumorali, altre cellule immunitarie e cellule stromali per ricreare il microambiente irradiato associato alla ricorrenza. Questo metodo sarà importante per valutare come il normale danno tissutale influenzi specificamente la dinamica delle cellule immunitarie e alla fine verrà utilizzato per comprendere i meccanismi di reclutamento delle cellule tumorali.
Gli organoidi mammari hanno meccanismi chiariti di sviluppo della ghiandola mammaria e hanno un cancro al seno robustamente riassunto in vitro. Speriamo che il nostro modello fornisca informazioni sul reclutamento di cellule tumorali indotte dalle radiazioni.
