Questo metodo può rilevare l'attività delle retrotrasposizioni chiamate LINE-1. Questi elementi genetici mobili causano inserimenti de novo nei genomi del cancro e quindi contribuiscono all'instabilità genomica. Il vantaggio di questa tecnica basata su PCR è che è semplice ed economica rispetto agli approcci di sequenziamento ad alta produttività.
Dimostriamo qui la sua utilità nel rilevare gli inserimenti de novo che provengono da un LINE-1 all'interno del gene TTC28 sul cromosoma 22 umano. L'attività LINE-1 può servire come biomarcatore per la malignità o la pre-malignità specialmente nei tipi di tumore epiteliale, come il cancro del colon o il cancro ovarico sieroso di alto grado. Oltre agli inserimenti LINE-1, questo metodo è in grado di rilevare altre aberrazioni genomiche, come riarrangiamenti del DNA che hanno sempre bisogno di riarrangiamenti per un motivo.
Per selezionare un enzima di restrizione adatto e progettare primer inversi, in primo luogo, scaricare la sequenza TTC28 LINE-1 in formato FASTA da un database LINE-1, come L1Base. L'ID L1Base per TTC28 Line-1 è 135. Includere cinque kilobase di sequenza, affiancando sia cinque primi che tre primi, fine della sequenza Linea-1.
Esportare la sequenza in un elaboratore di testi. Qui la sequenza di fianco Linea-1 è annotata in caratteri marroni e sequenze Line-1 in caratteri grigi. Per determinare il tag univoco in una sequenza di kilobase a valle dei tre primi di TTC28 Line-1 e in uno degli strumenti di previsione del segnale di poliadenilazione, come Polyadq o Dragon PolyA Spotter.
Annotare tutto il segnale di poliadenilazione in questa finestra di un chilo. La sequenza tra il segnale di poliadenilazione debole di TTC28 LINE-1 evidenziato qui in rosa e il segnale di poliadenilazione più forte a valle è il tag unico di questo LINE-1 evidenziato qui in giallo. Per progettare primer PCR inversi, inserire l'esclusiva sequenza di tag in uno strumento di progettazione di primer basato sul Web, come Primer-BLAST di NCBI che genera primer PCR specifici, mantenere il parametro di lunghezza del prodotto al minimo per mostrare che le coppie di primer sono vicine l'una all'altra.
Selezionare il database del genoma appropriato. Poiché l'uscita di Primer Blast genera primer PCR convenzionali uno di fronte all'altro, utilizzare la funzione di complemento inverso per la coppia di primer per eseguire PCR inverso. Primer inter-design, corrispondenti al segnale di poliadenilazione est quando possibile.
Abbiamo degnato tre coppie di primer, evidenziate in verde acqua e verde, corrispondenti a tre forti segnali di poliadenilazione nell'etichetta unica di TTC28 LINE-1. Successivamente, per selezionare un enzima di restrizione adatto, digerire la sequenza LINE-1, insieme ai suoi cinque kilobase a monte e ai fianchi a valle in silice utilizzando strumenti basati sul web, come RestrictionMapper. Questo darà un elenco completo di enzimi di restrizione che digerisce questo motivo, generando diversi frammenti di restrizione.
Selezionare enzimi di restrizione che fanno un taglio di cinque primi a monte dell'estremità primaria a cinque di LINE-1 o verso le cinque estremità prime della LINEA-1 se si trova all'interno della LINEA-1 stessa. E una carta prime tre a valle rispetto al tag univoco. Il frammento di restrizione nativo con sequenza LINE-1 e il suo tag univoco realizzato da enzimi di restrizione selettiva, non dovrebbe essere più lungo di 12 kilobase, in quanto potrebbe non essere amplificato dalla PCR in modo efficiente.
Si noti che gli enzimi di restrizione selettiva sarebbero insensibili alla metilazione del DNA, dovrebbero essere inattivabili dal calore e dovrebbero generare estremità appiccicoso che sono complementari tra loro. Per dimostrare la PCR inversa a lunga distanza, useremo l'enzima di restrizione SacI che taglia il DNA nei siti DAZCTC evidenziati qui in verde chiaro. SacI soddisfa tutti i criteri del locus TTC28 LINE-1 e genera un frammento di restrizione nativo di 5.700 coppie di basi.
Estrarre DNA genomico da campioni utilizzando kit di estrazione del DNA disponibile in commercio in grado di estrarre DNA molecolare di buona qualità e ad alta qualità necessario per la PCR inversa a lunga distanza. Qui abbiamo estratto DNA genomico dalla linea di cellule tumorali del seno MCF7 e sangue umano normale usando le istruzioni della manifattura. Misurare la concentrazione di DNA usando un fluorometro.
1000 nanogrammi di DNA su un gel di agarosio di una persona insieme a un marcatore di peso molecolare del DNA per controllare la qualità e la quantità del DNA. Per creare modelli circolari di DNA, prima digerire il DNA con un adeguato enzima di restrizione. Qui usiamo SacI per digerire MCF7 e DNA genomico del sangue Crea un mix di reazione di digestione secondo il protocollo di testo.
Mescolare la soluzione facendo scorrere brevemente il tubo e la centrifuga. Incubare la miscela di reazione a 37 gradi Celsius per un'ora seguita da inattivazione del calore, secondo le istruzioni del produttore. Successivamente, crea una soluzione di mixaggio del master di reazione di legatura secondo il protocollo di testo per auto-legare il DNA digerito.
Per ogni reazione, aggiungere 30 microlitri di questo master di reazione di legatura direttamente a 50 microlitri di soluzione di DNA digerito del passaggio precedente. Mescolare la soluzione facendo scorrere brevemente il tubo e centrifugando il tubo. Incubare questa miscela di reazione in un ciclore termico a 22 gradi Celsius per 10 minuti, terminando con una fase di inattivazione termica a 60 gradi Celsius per altri 10 minuti.
Questo modello di DNA circolare verrà utilizzato nel successivo passaggio PCR inverso. Impostare un gradiente di temperatura di ricottura in un ciclore termico per determinare la temperatura di ricottura ottimale del primer in base alla PCR sfumato. Preparare un master mix per il PCR combinando e mescolando tutti i componenti in base al protocollo di testo.
Impostare una reazione per ogni temperatura di ricottura nel gradiente. Per ogni reazione, allocare 19 microlitri dei tubi PCR master mix e aggiungere un microlitro di modello di DNA circolare, generato dal DNA genomico del sangue. Eseguire il programma PCR sfumato.
Eseguire sei microlitri di prodotto PCR, riscaldarlo a diversa temperatura di ricottura in un corso in gel di agarosio. Per rilevare l'attività di retrotrasposizione de novo TTC28 LINE-1 nel genoma della linea cellulare MCF7, eseguire PCR utilizzando la coppia di primer inversi su modelli di DNA circolari, generati dalla linea cellulare MCF-7. Seguire le stesse istruzioni della PCR sfumato, ma questa volta sostituendo il gradiente di temperatura con una temperatura di ricottura ottimale, che è di 64 gradi Celsius.
Analizza i prodotti PCR inversi a lunga distanza con gel di agarosio per i risultati. Questa immagine di gel di agarosio scattata dopo un elettroforesi mostra il DNA genomico estratto da MCF7 e campioni di sangue hanno un alto peso molecolare, rendendolo adatto per PCR inversa a lunga distanza. Questa immagine in gel di agarosio scattata dopo l'elettroforesi mostra che la coppia di primer inversi che abbiamo progettato amplifica il modello circolare corretto a tutte le temperature di ricottura nel gradiente osservate da un'estensione intensa compresa tra 5 kilobase e sette kilobase di DNA marker.
Tuttavia, varie bande sono osservate anche a temperature più basse, indicando scarsa specificità del primer e scarse temperature di ricottura. Pertanto, per questa coppia di primer, 64 gradi Celsius è la temperatura di ricottura ottimale. Questa immagine in gel di agarosio mostra il prodotto PCR ottenuto dopo aver eseguito PCR inverso a lunga distanza su DNA estratto dalla linea cellulare MCF7 e sangue normale.
Un prodotto PCF di 5.700 coppie di basi, contrassegnato da un asterisco, rappresenta la PCR nativa corrispondente alla Linea-1 nel suo locus nativo. Questo prodotto PCR nativo è visibile sia nell'MCF7 che nel DNA del sangue normale. La retrotrasposizione De novo LINE-1 e il genoma MCF7 sono rilevabili come prodotto PCR di diverse dimensioni, insieme al prodotto PCR nativo nel gel di agarosio.
Sequenziare il prodotto PCR inverso a lunga distanza mediante tecnologie di sequenziamento a lettura lunga a singola molecolare può consentire l'identificazione dell'identificazione del bersaglio in una risoluzione a tenuta nucleare. Sebbene sia possibile anche un approccio ingombrante, la clonazione e il sequenziamento sanger del prodotto PCR inverso a lunga distanza. In questo video è stata rilevata l'attività di un LINE-1 sul cromosoma 22.
Lo stesso flusso di lavoro può essere adattato per monitorare altri LINE-1 che sono attivi in diversi tipi di tumore.
