Questa tecnica è un modo affidabile per fornire qualsiasi contenuto come farmaci, proteine o cellule in luoghi specifici in tessuti o animali. È possibile tenere traccia della consegna e ottimizzare il rilascio del contenuto in base all'esperimento che si desidera. Può essere usato per trattare numerose malattie dalla guarigione delle ferite alle malattie oculari e cardiache.
Il principale vantaggio di questo metodo è la capacità di fornire cellule terapeutiche utilizzando microcapsule alginate ai siti bersaglio senza causare reazioni immunitarie e mantenere un parto prolungato di terapie appena secrete per un periodo di tempo più lungo. Inizia coltivando cellule epiteliali retiniche secondo le indicazioni manoscritte. Passare le cellule quando raggiungono il 70-80% di confluenza utilizzando procedure standard di coltura tissutale.
Per incapsulare le cellule, mescolare l'alginato di sodio con acqua deionizzata per una concentrazione finale del 2% di peso in volume e purificare la miscela tramite filtrazione con un filtro siringa sterile da 0,2 micrometri. Tripinare, centrifugare e lavare le cellule con soluzione salina tamponata HEPES da 10 millimolare. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule e regolare la concentrazione cellulare finale a un milione per un millilitro di soluzione di alginato.
Caricare 300 aliquote microlitri dell'alginato e le cellule si mescolano in una siringa da tre millilitri e attaccarla a una pompa per siringhe. Preparare un bagno gelificante secondo le indicazioni manoscritte e posizionare in un becher sterile da 50 millilitri sotto la punta della siringa con un ago di sette millimetri per bagnare la distanza di spruzzatura. Regolare la tensione a otto kilovolt e la portata a 30 millimetri all'ora per produrre microcapsule di dimensioni di circa 150 micrometri.
Collegare la clip di terra nera al filo di rame che è a metà del bagno di gelata e collegare la clip del filo anodo rosso all'ago. Ci vogliono circa 30 minuti per preparare le cellule incapsulate da ogni lotto di millilitro dell'alginato e della miscela cellulare. Una volta formate, lavare due volte le microcapsule con soluzione di lavaggio e incubarle con mezzi DMEM integrati al 10%FBS in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5%CO2.
Dopo un'incubazione 24 ore su 24, preparare un campione di microcapsule da 500 microliter per la colorazione lavandoli due volte in soluzione di lavaggio. Utilizzare un kit di saggi LIVE/DEAD per macchiarli per la vitalità. Per assicurarsi che le microcapsule siano dimensionate in modo appropriato, diluirle in mezzi senza siero.
Aspirateli con cura con una siringa Hamilton da 2,5 microliter. Espellere lentamente un microlitro cadere su uno scivolo del microscopio e determinare l'integrità delle microcapsule utilizzando un microscopio Brightfield verticale. In un topo opportunamente anestetizzato, applicare il lubrificante oculare per mantenere l'umidità degli occhi e utilizzare un ago per siringhe smussato da 26 gauge da 3/8 pollici per stabilire una puntura oculare iniziale appena sotto il limbo.
Assicurarsi di avvicinarsi all'occhio da una direzione nasale con un angolo di 45 gradi mantenendo la punta smussata verso l'alto per evitare la perforazione dell'obiettivo. Successivamente, assicurarsi che l'intera punta dell'ago sia inserita nell'occhio per la generazione del foro guida, ma fare attenzione a non andare troppo lontano e forare la retina temporale. Una volta completato questo, ritrarre lentamente l'ago.
All'interno del micromanipolatore, posizionare una siringa Hamilton a punta smussata calibro 27 da 27 calibri riempita con soluzione di capsula e allineare l'ago con il foro guida iniziale. Tenere la testa dell'animale in una posizione stabile e manovrare deliberatamente l'ago verso l'occhio. Per garantire una corretta posizione dell'ago all'interno del vitreo, inserire la siringa fino a quando la punta dell'ago non può essere visualizzato dietro l'obiettivo.
Quindi iniettare lentamente la soluzione della capsula nel corso di 25-30 secondi. E una volta completata, ritrarre gradualmente la siringa con punta smussata per ridurre al minimo le lesioni all'occhio. Se necessario, regolare la dimensione della capsula regolando la tensione e la portata in base alle direzioni del manoscritto.
L'incapsulamento delle cellule nell'alginato è stato confermato con l'imaging Brightfield e un test LIVE/DEAD ha dimostrato che il 90% delle cellule erano post-incapsulamento praticabili. La vitalità a lungo termine delle cellule è stata assicurata sciogliendo le capsule in citrato di sodio e ripiazzando. L'iniezione intravitreale è stata eseguita sotto ispezione visiva che ha permesso la visualizzazione delle capsule nel vitreo.
Quando si tenta questa procedura, non utilizzare PBS per alcuna procedura di lavaggio perché PBS dissolve le microcapsule alginate formate. Dopo il suo sviluppo, il nostro laboratorio viene utilizzato come sistema di consegna per trattare forme di insufficienza cardiaca e ipertensione. Questa tecnica è considerata uno strumento promettente per il futuro trattamento di diverse malattie cardiovascolari e neurologiche.
