La mappatura del circuito assistito da channelrhodopsin è una tecnica di precisione per la mappatura funzionale di proiezioni neurali a lungo raggio. Qui, mostriamo come usare questo approccio per indagare i circuiti nel tronco uditivo del cervello. Nelle fette cerebrali, gli assoni provenienti da più fonti sono spesso intermixati, rendendo difficile isolare i singoli input usando la stimolazione elettrica.
Utilizzando CRACM, questa limitazione può essere superata. Trovare lambda e definire costantemente il sistema di coordinate stereotassiche è impegnativo così come mantenere breve la durata della procedura. Avere tutti i passaggi accuratamente mappati aumenterà il tuo tasso di successo.
Inizia spruzzando l'area chirurgica con il 70% di etanolo per sanificare e posizionare tende per asciugamani sterili per coprire l'area dell'intervento chirurgico. Rimuovere la lettiera a gabbia per limitare il rischio di asfissia dalla gabbia di recupero. Quindi, metti una pastiglia di riscaldamento sotto la gabbia e fornisci una fonte di cibo e acqua.
Successivamente, trasferire l'animale in una cornice stereotassica e continuare l'anestesia. Inserire una sonda di temperatura rettale e accendere il regolatore di temperatura omeostatico. Quindi, applicare un unguento oftalmico per evitare che gli occhi si asciughino.
Somministrare analgesico preemptivo. Infine, radere il cuoio capelluto con tosaerba elettriche. Disinfettare il cuoio capelluto con tre tamponi alternati di iodio di povidone e 70% di etanolo.
Inizia l'intervento chirurgico facendo un'incisione nel cuoio capelluto lungo la linea mediana, iniziando tra le orecchie e continuando rostrale agli occhi, esponendo le suture lambda e bregma. Spingere la pelle di lato e rimuovere il periostio dall'osso esposto, se necessario. Quindi, contrassegnare la sutura lambda con un marcatore chirurgico, posizionare la punta del nano-iniettore in modo che tocchi solo lambda e azzerare le coordinate del micromanipolatore.
Utilizzare la punta del nano-iniettore e il micromanipolatore per misurare la differenza di elevazione tra le suture lambda e bregma. Regola l'altezza della barra della tavolozza per portare lambda e bregma entro più o meno 100 micrometri di differenza di altezza. Mappare il sito di iniezione utilizzando la punta del nano-iniettore e il sistema di coordinate del micromanipolatore e contrassegnare il sito con un marcatore chirurgico.
Quindi, utilizzare un trapano micromotore con una bava di perforazione di 0,5 millimetri per eseguire una craniotomia sul sito di iniezione. Per garantire un'ampia trasfezione dei neuroni nel nucleo bersaglio, utilizzare un nano-iniettore per fare iniezioni a varie profondità nel tessuto e nel caso di regioni cerebrali più grandi, come il collicolo inferiore, fare iniezioni nel corso di due o più penetrazioni a diverse coordinate X e Y. Per iniettare il collicolo inferiore, depositare 20 nanolitri di virus negli intervalli di 250 micrometri lungo l'asse Z tra 2.250 micrometri e 1.750 micrometri di profondità.
Per le iniezioni nel nucleo cocleare dorsale, depositare 20 nanolitri di virus a una profondità rispettivamente di 4.750 micrometri e 4.550 micrometri. Dopo aver iniettato ad ogni coordinata Z, attendere da due a tre minuti prima di spostare l'iniettore alla coordinata Z successiva per consentire al virus di diffondersi lontano dal sito di iniezione, riducendo la probabilità che il virus venga risucchiato nel tratto di iniezione quando il nano-iniettore viene riposizionato. Quindi, dopo l'ultima iniezione, attendere da tre a cinque minuti prima di ritrarre il nano-iniettore dal cervello.
Quando il nano-iniettore viene rimosso dal cervello tra le penetrazioni e tra gli animali, espellere un piccolo volume di virus dalla punta per verificare che la punta non si sia intasata. Dopo le iniezioni, utilizzare PBS sterile per bagnare i bordi tagliati del cuoio capelluto e quindi spostare delicatamente la pelle verso la linea mediana. Chiudere la ferita con semplici suture interrotte utilizzando 6-0 suture di nylon.
Quindi, applicare 0,5 a un millilitro di gelatina di lidocaina al 2% sulla ferita. Rimuovere le barre dell'orecchio e la sonda di temperatura, girare l'isoflurane e rimuovere l'animale dalla barra della tavolozza e trasferirlo nella gabbia di recupero. Infine, monitorare attentamente la ripresa.
Una volta che l'animale è completamente sveglio, muovendosi e non mostrando segni di dolore o angoscia, trasferiscilo di nuovo nella sua gabbia e riporta la gabbia al vivaio. Utilizzare metodi standard di patch clamp per effettuare registrazioni. Inizia posizionando la fetta in una camera di registrazione sotto un microscopio verticale a stadio fisso e continuamente abbondante con liquido cerebrospinale artificiale a due millilitri al minuto.
Successivamente, patch neuroni sotto controllo visivo utilizzando un amplificatore patch clamp adatto. Infine, durante le registrazioni all'ingrosso, attivare Chronos fornendo brevi impulsi di luce di 470 nanometri o ChrimsonR con brevi impulsi di luce di 580 nanometri attraverso LED disponibili in commercio. I risultati hanno indicato che l'iniezione di ChrimsonR ha portato a una forte espressione nel DCN con fluorescenza tdTomato visibile in cellule e fibre.
Nell'ICC contralaterale, le fibre fortemente etichettate con tdTomato erano chiaramente visibili dopo tre settimane, dimostrando la capacità di traffico a lungo raggio del costrutto ChrimsonR-tdTomato quando iniettate nei nuclei uditivi del tronco encefalico. Attivazione ottica di EPS elicted ChrimsonR nei neuroni VIP IC, indicando che ChrimsonR è uno strumento utile per esperimenti CRACM a lungo raggio quando i parametri sperimentali richiedono l'uso della luce rossa invece della luce blu. Tuttavia, abbiamo scoperto che ChrimsonR è stato prontamente attivato con la luce blu, mostrando la stessa soglia per l'attivazione della luce blu di Chronos.
Per questo protocollo è più importante assicurarsi che le coordinate stereotassiche siano corrette e confermare che il virus è stato espresso solo nella regione cerebrale mirata. Scambiando il virocostruzione Chronos ChrimsonR con un virus diverso, ad esempio un virus Flex specifico per le cellule, è possibile rispondere a diverse domande anatomiche o fisiologiche senza modificare il protocollo chirurgico.
