Questo metodo può confermare la capacità organoido-formante di epitelio villi de-differenziante che acquisiscono marcatori di cellule staminali in vivo. La raccolta dei villi viene eseguita tramite raschiatura piuttosto che il metodo di chelazione EDTA che impedisce la completa perdita del mesenchima sottostante che può fornire i segnali di nicchia se necessario per l'inizio degli organoidi. Questo metodo è applicabile nei tessuti epiteliali in cui i compartimenti proliferativi e differenziati sono fisicamente delineati e le cellule de-differenzianti esprimono marcatori di cellule staminali in vivo.
Alcuni fattori in questo protocollo devono essere determinati empiricamente, tra cui lo stadio ottimale per la raccolta dei villi e la pressione ottimale per raschiare i villi, che richiederà tempo e pratica. Indurre la mutazione Smad4 knockout e beta-catenina guadagno di funzione in topi mutanti con iniezione intraperitoneale di tamoxifene e olio di mais per quattro giorni consecutivi. Dopo l'eutanasia del topo, spruzzare l'addome con etanolo al 70% per evitare che la pelliccia del topo entri nella cavità peritoneale.
Aprire la cavità addominale con le forbici di dissezione per esporre l'intestino e isolare l'intestino usando forbici e pinza. Sezionare la metà prossimale del duodeno, quindi sciacquare il duodeno con cinque millilitri di PBS ghiacciato in una siringa da 10 millilitri per eliminare il contenuto luminale. Aprire il duodeno longitudinalmente con una forbice angolata e adagiare il duodeno piatto su una capsula di Petri di 15 centimetri su ghiaccio con il lume del duodeno rivolto verso l'operatore.
Prima di iniziare la raschiatura, posizionare un filtro a rete da 70 micrometri in uno dei pozzetti di una piastra di coltura tissutale a sei pozzi. Riempire tutti i pozzi con quattro millilitri di 1X PBS e posizionare la piastra sul ghiaccio. Raschiare i villi usando due microscopici vetrini, uno per tenere il duodeno verso il basso e l'altro per raschiare.
Raschiare superficialmente il lato luminale del duodeno due volte per rimuovere il muco senza rimuovere i villi, quindi raschiare il duodeno altre due volte per raccogliere i villi sui vetrini senza legare le cripte. Utilizzare una pipetta di trasferimento da un millilitro contenente PBS per trasferire i villi in un filtro a rete da 70 micrometri nel piatto a sei pozzetto. Raccogli i villi dopo ogni graffio.
Per rimuovere le cripte sciolte, lavare i villi raccolti con il filtro da 70 micrometri trasferendo il filtro attraverso una serie di pozzetti nel piatto a sei pozzetti contenente quattro millilitri di PBS ghiacciato per pozzetto. Utilizzando una pipetta P1000, trasferire la sospensione dei villi in circa tre millilitri di PBS dal filtro da 70 micrometri a un nuovo tubo da 15 millilitri su ghiaccio. Utilizzare una punta della pipetta P200 smussata rivestita con rivestimento BSA allo 0,1% per trasferire un volume di 50 microlitter della sospensione dei villi su una slitta di vetro.
Contare il numero di villi nella goccia da 50 microlitri sotto ingrandimento 4X per determinare la concentrazione di villi nella sospensione PBS e per confermare l'assenza di cripte tethered. Per placcare i villi, utilizzare una punta della pipetta smussata P200 rivestita con BSA allo 0,1% per trasferire i villi in un tubo microcentrifuga per una densità di placcatura di sei villi per pozzetto in 12,5 microlitri di matrice BME-R1. Girare verso il basso i villi per due minuti a 200 volte G a quattro gradi Celsius.
Rimuovere il surnatante e ripetere la centrifugazione per rimuovere eventuali PBS residui. In una cappa a flusso laminare, risusciere delicatamente il pellet di villi nella quantità richiesta di BME-R1 freddo scongelato sul ghiaccio. Utilizzando una pipetta P20, piastra 12,5 microlitri dei villi in matrice BME-R1 per pozzetti di una piastra con fondo a U a 96 pozzetti preriscaldata a 37 gradi Celsius.
Incubare la piastra in un incubatore di colture tissutali a 37 gradi Celsius per 15 minuti per consentire la solidificazione della matrice BME-R1. A ciascun pozzo, aggiungere 125 microlitri di supporti ENR preriscaldati integrati come descritto nel manoscritto di testo. Incubare i villi placcati in un incubatore di colture tissutali a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e cambiare il mezzo a giorni alterni.
Scartare qualsiasi pozzo in cui gli organoidi compaiono prima di due giorni. C'è una differenza nell'aspetto degli organoidi che emergono dalle cripte rispetto all'epitelio villi de-differenziato dallo stesso intestino di topo. Gli organoidi derivati dalla cripta appaiono durante la notte come strutture sferiche con bordi ben definiti.
È stata esaminata la cinetica e l'aspetto morfologico degli organoidi iniziati dai villi, che all'inizio appaiono di forma irregolare e richiedono da due a cinque giorni prima di poter essere visti al microscopio. Viene mostrata l'iniziazione organoide da due diversi villi. I villi con potenziale organoide-formante appaiono densi, probabilmente a causa della ritenzione del mesenchima sottostante.
L'iniziazione organoide dalle ville è evidente al secondo giorno da uno dei villi. Mentre nelle altre ville, l'organoide appare al quarto giorno. È fondamentale adottare le misure appropriate per evitare la contaminazione della cripta durante la raccolta dei villi e la coltivazione degli organoidi risultanti.
Differenze fenotipiche tra gli organoidi emergenti dalle cripte e i villi dello stesso mutante sono state osservate seguendo questa procedura, quindi ulteriori sperimentazioni potrebbero essere effettuate per cercare differenze molecolari tra i due. Questo protocollo potrebbe essere utilizzato per studiare le differenze tra organoidi derivanti da cripte endogene rispetto a cripte ectopiche derivanti dalla de-differenziazione, quindi le implicazioni della de-differenziazione potrebbero essere affrontate.
