L'enumerazione delle unità formanti colonie limitava la riproducibilità della ricerca nel campo delle UTI. L'imaging a bioluminescenza farà progredire la ricerca UTI in vivo sulla fisiologia della vescica, la patogenesi e la suscettibilità dell'UTI. L'imaging a bioluminescenza consente il follow-up longitudinale con informazioni in tempo reale sull'evoluzione dell'infezione.
Inoltre, riduce drasticamente il numero di animali necessari. L'imaging a bioluminescenza facilita la ricerca sulle infezioni ricorrenti o croniche, che sono frequenti negli esseri umani. Inoltre, i ricercatori possono identificare infezioni ascendenti o diffusione al sangue utilizzando l'imaging a bioluminescenza.
Ottieni singole colonie strisciando lo stock di glicerolo di batteri con un ciclo di inoculazione su piastre LB integrate con kanamicina solfato e coltivando durante la notte a 37 gradi Celsius. Riempire un tubo di fondo rotondo sterile in polistirene da 14 millilitri, con tappi a scatto a doppia posizione con cinque millilitri di brodo LB integrati con kanamicina solfato. Scegli una singola colonia batterica con un ciclo di inoculazione e aggiungilo al brodo LB.
Vortice per 10 secondi per garantire una corretta miscelazione. Coltura statica con il tappo a scatto in posizione aperta a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione, ruotare il tubo per 10 secondi per garantire una corretta omogeneizzazione della coltura batterica.
Fai una sottocoltura nell'Erlenmeyer aggiungendo 25 microlitri della sospensione batterica a 25 millilitri di terreno LB fresco senza antibiotici. Chiudere l'Erlenmeyer e la cultura staticamente durante la notte. Il giorno dell'installazione, versare la coltura dell'Erlennmeyer in un tubo di coltura da 50 millilitri e centrifugare.
Decantare il surnatante e risospese il pellet batterico in 10 millilitri di PBS sterile. Vortice di nuovo il tubo per 10 secondi. Scegli la concentrazione sperimentale dell'inoculo e determina l'OD corrispondente a 600 nanometri usando la curva standard.
Aggiungere un millilitro della coltura batterica risospesa in nove millilitri di PBS sterile e regolare fino a raggiungere l'OD 600 nanometro desiderato. Montare una punta angiocatetere sterile calibro 24 su una siringa da 100 microlitri. Riempire la siringa con la soluzione batterica preparata.
Posizionare un animale su una superficie di lavoro in posizione supina e mantenere un'anestesia isoflurano stabile utilizzando un cono nasale durante l'installazione. Applicare l'unguento per gli occhi. Espellere l'urina residua applicando una leggera compressione e facendo movimenti circolari sulla regione sovrapubica, quindi pulire l'addome inferiore con il 70% di etanolo.
Lubrificare la punta del catetere con soluzione salina normale. Metti l'indice sulla mano non dominante sull'addome e spingilo delicatamente verso l'alto. Avviare il cateterismo dell'uretra verticalmente in un angolo di 90 gradi.
Una volta incontrata la resistenza, inclinarla orizzontalmente prima di inserirla ulteriormente. Eseguire un'installazione lenta di 50 microlitri dell'inoculo batterico. Dopo l'installazione, tenere la siringa e il catetere in posizione per qualche altro secondo e poi ritrarsi lentamente per evitare perdite.
Utilizzare un catetere per gruppo sperimentale. Posizionare l'animale in posizione supina nel cono del naso per prepararlo per l'imaging e prepararlo per l'imaging utilizzando un catetere per gruppo sperimentale. Se necessario, somministrare antibiotici o farmaci sperimentali, come menzionato nel manoscritto del testo.
Aprire il software di acquisizione BLI e fare clic su Inizializza nel dispositivo di imaging per testare la fotocamera e il sistema di controllo dello stage e per raffreddare la fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica a meno 90 gradi Celsius. Fare clic su Acquisizione, Salvataggio automatico a.Seleziona Luminescenza e Fotografia. Controllare le impostazioni luminescenti predefinite impostando il filtro di eccitazione su Blocca e il filtro di emissione su Apri.
Imposta il tempo di esposizione su auto quando scatti la prima immagine. Per le misurazioni in vivo e i segnali luminosi, impostare il tempo di esposizione a circa 30 secondi. Ridurre il tempo di esposizione se viene visualizzato un avviso a causa di un'immagine satura.
Selezionare il binning medio, F/stop one, e scegliere il FOV corretto. Impostare l'altezza del soggetto su un centimetro durante l'imaging dei topi. Immagina fino a cinque miglia contemporaneamente e separa gli animali usando il deflettore di luce per impedire la riflessione.
Chiudi la porta e fai clic su Acquisisci per avviare la sequenza di imaging, quindi inserisci informazioni dettagliate sull'esperimento. Rimuovere i topi dalla camera di imaging e riportarli nella loro gabbia. Verificare il recupero completo dopo l'anestesia, quindi restituire le gabbie ai rack ventilati fino al successivo ciclo di imaging.
Avviare il software di imaging e caricare il file sperimentale facendo clic su Sfoglia. Utilizzare la tavolozza degli strumenti per regolare la scala dei colori dell'immagine. Utilizza gli strumenti ROI per disegnare una regione di interesse sull'immagine, assicurandoti che sia abbastanza grande da coprire l'area completa e utilizzando le stesse dimensioni per tutte le immagini.
Quindi fare clic su Misurazione del ROI per quantificare l'intensità della luce. Le successive immagini di topi ottenute immediatamente dopo l'installazione hanno mostrato che era robustamente rilevabile sopra le 20.000 unità formanti colonie, ed è stata stabilita una correlazione lineare tra le unità formanti colonie dell'inoculo e la bioluminescenza in vivo. La naturale evoluzione di un'infezione del tratto urinario è stata studiata in un gruppo di controllo che non ha ricevuto alcun trattamento.
L'effetto del trattamento antibiotico sulla cinetica dell'infezione è stato visualizzato in dettaglio in un gruppo di animali trattati con antibiotici. Una diminuzione immediata della carica batterica, misurata dal flusso totale di fotoni, è stata osservata dopo la prima dose di enrofloxacina. Nessuno degli animali trattati ha avuto un successivo aumento della carica batterica.
La carica batterica complessiva di ciascun animale è stata calcolata utilizzando l'area sotto la curva del flusso totale di fotoni trasformato nel log, mostrando una differenza significativa tra gli animali trattati con enrofloxacina e gli animali non trattati nel corso di 10 giorni. Questi risultati forniscono la prova del concetto che BLI può essere utilizzato per valutare le differenze nella cinetica dell'infezione UTI. L'imaging a bioluminescenza è una tecnica non invasiva che può essere combinata con altri metodi come la raccolta regolare di campioni urinari per l'analisi batterica o biochimica o per gli esperimenti.
Qui abbiamo dimostrato che l'imaging a bioluminescenza è un potente strumento per valutare nuove strategie terapeutiche sul decorso della malattia delle infezioni del tratto urinario.
